Coltura di calli in vitro e trasformazione genetica delle piante

Che cos'è la coltura di calli in vitro?

Bisogna stabilire una coltura di calli in vitro. Bisogna partire da un espianto, exiderlo e trasferirlo in vitro e indurre la comparsa dei calli in base citochina e auxina.
La carota è uno studio modello per l’embriogenesi somatica. Si prende un espianto, con i germogli ottenuti si prendono le estremità. Dalle porzioni di ipocotili si formerà del callo. Questi sono calli embriogenesi (forte potenziale a creare embrioni  somatici). 

Selezione e conteggio delle PEM

1. si ottiene una linea di cellule di callo in sospensione partendo da piccoli frammenti di ipocotile excisi da piantule germinate in vitro da semi sterilizzati.

2. si seleziona una sottopopolazione embriogenetica: masse pro-embriogeniche (masse pro embriogeniche) che si distinguono perché hanno una dimensione diversa. Mediante filtrazione, si fa una selezione in base alla dimensione. Si effettua un conteggio per sapere la concentrazione dei PEM, il conteggio viene effettuato al microscopio ottico. 

Rimozione del fitormone auxina

3. si rimuove il fitormone auxina dal mezzo di coltura altrimenti non si avrà lo sviluppo di embrioni somatici. 

4. si  effettua il conteggio e si diluisce la popolazione di  PEMs nel terreno di coltura. Non si scende al di sotto di una certa densità perché altrimenti le cellule muoiono. La giusta densità produce nel liquido dei segnali che vengono percepiti nelle cellule vicine che a loro volta rendono più potente e intensa l’attività di proliferazione e crescita.

Potenziale embriogenico delle colture

Il potenziale embriogenico di una coltura di cellule vegetali è elevato quando la coltura è giovane (

-Stella di natale (Euphorbia pulcherrima)

-Sweet orange (Citrus sinensis)

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Rigenerazione nelle cellule animali

Come si comportano le cellule animali? Negli animali ci sono degli esempi di sistema di rigenerazione ad esempio negli arti degli anfibi oppure negli invertebrati. Per rigenerare si passa attraverso uno step intermedio di blastema.
Per poter produrre una pianta geneticamente modificata si vede avere un buon protocollo in vitro.

Trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens.

Per es ha tumore formato dalle cellule altamente specializzate, cellule producono grosse quantità di opine che sono forme modificate di aminoacidi, ricchi in C e N utilizzato dall’agrobacterium  come nutrimento. Il T-DNA contiene non solo geni che  consentono sintesi di auxine citochinine ma porta anche i geni che codificano per la sintesi di opine (octopina, mannopina). Un ceppo di A.T con mannopina avrà geni che serviranno per la sintesi solo per la mannopina, questa secreta dal tumore nel suolo potrà essere utilizzata solo da questo ceppo.

Funzione del T-DNA

T-DNA= abbiamo regioni terminali, che sono corte sequenze ripetute che sono riconosciute da endonucleasi di tipo vir che sono prodotte e accumulate nel momento in cui parte il processo di infezione. Le endonucleasi vir riconoscono e legano in maniera specifica le regioni Lb e Rb, tagliano e si excide un singolo filamento. Rb andrà a dirigere il T DNA. Il filamento singolo di DNA verrà ricoperto da proteine di tipo vir codificate da questo locus. Viaggia attraverso il canale proteico costituito da proteine vir di tipo b. Nel T-DNA abbiamo gene che codifica per le auxine e le citochinine.