Duplicazione DNA, Controllo e Correzione filamenti neosintetizzati

-il Dna deve potersi duplicare per trasmettere le informazioni ereditarie…

Se consideriamo questa molecola come una scala a pioli, i “montanti” sono formati da legami covalenti tra il gruppo fosfato (in posizione 5’) e il carbonio 3’, e sono molto forti;

mentre nei “pioli” ci sono legami a idrogeno tra le basi azotate complementari, e sono più deboli;

saranno proprio quest’ultimi a spezzarsi (nella fase S del ciclo cellulare) per ottenere due filamenti stampo da cui ottenere due filamenti nuovi.

La duplicazione è un meccanismo semiconservativo in cui alla fine si ottiene due nuove molecole di Dna, ciascuna formata da un filamento vecchio (o stampo) ed uno neoformato…

…ma come fa la molecola di Dna a spezzarsi e a creare due filamenti stampo?

Ruolo degli enzimi nella duplicazione

Sono necessari degli enzimi specifici (proteine che incastrando nel loro sito attivo delle molecole specifiche dette substrato, velocizzano le reazioni)

1)il primo enzima ad agire è la topoisomerasi: despiralizza il filamento di Dna

2)l’elicasi agisce quasi contemporaneamente al precedente: rompe i legami a idrogeno tra le basi azotate;

l’elicasi agisce riconoscendo un’origine (Ori);

nei procarioti sono presenti più Ori, quindi i filamenti di DNA si apriranno in più punti:

in questi specifici punti si formano delle bolle di replicazione delimitate dalle forcelle di replicazione (due strutture ad “Y”).

3)le basi divise, essendo complementari, tendono a riunirsi;

in questo caso agisce la proteina Ssb, che ponendosi sui filamenti ne evita la chiusura.

4)agisce adesso la Dna polimerasi, che unisce nuovi nucleotidi al filamento stampo, a partire da uno specifico punto in cui si trova il primer (corta catena di Dna), che funge appunto da innesco.

5)il primer è situato sul filamento vecchio e viene creato ed attaccato dall’enzima Rna primasi solo all’estremità 3’ di questo filamento;

Processo di replicazione del Dna

A questo punto la Dna polimerasi agisce in modo bidirezionale:

(Ricorda che le molecole di Dna sono formate da due filamenti antiparalleli, uno 3’-5’ e l’altro 5’-3’)

nel filamento vecchio 3’-5’ (detto filamento veloce) della molecola di DNA, il primer viene attaccato all’inizio del filamento (perché vi è subito un’estremità 3’ libera) e la DNA polimerasi, attaccandosi al primer, scorre ininterrottamente verso destra (3’-5’) e crea un filamento nuovo 5’-3’ antiparallelo a quello iniziale.

Formazione dei frammenti di Okazaki

Però l’altro filamento vecchio della molecola di Dna che funge da stampo è un filamento 5’-3’ (detto filamento lento), perciò l’rna primasi non trova un’estremità 3’ libera all’inizio del filamento ed attacca il primer alle estremità 3’ che trova all’inizio di ogni bolla di replicazione;

per fare ciò però i primer devono essere molteplici e posizionati di volta in volta in prossimità della forcella di replicazione;

in questo modo la DNA polimerasi scorre a ritroso ed in modo discontinuo formando dei frammenti di DNA nuovo detti frammenti di Okazaki.

6)i frammenti di Okazaki verranno legati tra loro per ottenere il filamento nuovo dall’enzima ligasi (solo alla fine della duplicazione);

il filamento nuovo in questo caso sarà 3’-5’.

7)dato che il filamento lento viene replicato a ritroso e si formano solo dei frammenti inizialmente, quando il filamento veloce avrà già finito la replicazione, il primo avrà solo creato un filamento nuovo più corto…

…com’è possibile che non vengano perse informazioni (basi azotate)?

7)tutti i cromosomi hanno dei telomeri:

sono lunghe sequenze di basi azotate ripetute e prive di senso poste all’estremità dei cromosomi;

mano a mano che il DNA si duplica, quando tutte le sequenze vengono perse la cellula muore (quindi invece di perdere basi azotate che portano inofrmazioni ereditarie, vengono perse queste ripetizioni prive di senso);

(aprendo una parentesi sulle basi ripetute è necessario sapere che esistono tre tipi di sequenze:

ripetizioni brevi in tandem: lunghe da 1 a 5 bp (paia di basi) ripetute fino a 100 volte; costituiscono il Dna microsatellite.

Sequenze moderatamente ripetute: presenti da 10 a 1000 volte; si spostano in vari punti del genoma e sono dette elementi trasponibili.

Sequenze altamente ripetute: lunghe 100 bp, sono le più numerose e sparse in tutto il genoma).

8)alla fine della duplicazione, quando abbiamo già ottenuto i due nuovi filamenti:

avviene il controllo e la correzione.

avvengono due tipi di controlli:

-selezione delle basi: avviene mediante la capacità della Dna polimerasi di compiere legami fosfodiesterici;

se due nucleotidi sono appaiati correttamente (tra uno del filamento vecchio ed uno del filamento nuovo) l’enzima è in grado di formare un legame fosfodiesterico tra di essi;

inoltre una base si può legare ad una base non complementare, ma quest’ultima non potrebbe entrare poi nel sito attivo del Dna polimerasi, in questo modo i molti legami errati vengono scartati già prima della “selezione delle basi” (meccanismo precedentemente spiegato).

-correzione di bozze(proofreading): basato sulla capacità della Dna polimerasi di controllare ogni nucleotide dopo che è stato aggiunto;

se il nucleotide inserito non è corretto, l’enzima lo rimuove e posiziona al suo posto quello corretto.

Questi due tipi di controlli agiscono in modo combinato, riducendo gli eventuali errori della duplicazione al minimo.

Riparazione:

avvengono due tipi di riparazioni:

-sistema mismatch repair (costiutito da 12 proteine): trova gli errori sfuggiti al proofreading, riconosce il filamento da riparare e sostituisce il nucleotide errato grazie alla Dna polimerasi e la ligasi (2 delle 12 proteine).

-sistema riparazione per escissione: agisce sulle basi anomale spezzando i legami fosfodiesterici tra le basi anomale e lasciandole separate; agisce poi la Dna polimerasi: sintetizza il frammento mancante e la ligasi lo salda alla catena.