Riassunti genetica 51

Approfondimento Meccanismo di splicing

La maggior parte dei geni nucleari presenta sequenze non codificanti

dette introni che interrompono quelle codificanti. Tali interruzioni sono

definite come sequenze intercalari alle quali è riconosciuta una funzione

regolatrice mentre le sequenze codificanti che si traducono cioè in

proteine, rappresentano gli esoni. Il trascritto primario di mRNA deve

essere reso attivo prima di spostarsi nel citoplasma. Affinchè un RNA

sia funzionale è necessario che i trascritti siano rielaborati all’interno

del nucleo attraverso un meccanismo di splicing per la creazione di

molecole di mRNA attive lo splicing dei pre mRNA implica, da un lato la

sospensione negli mRNA precursori degli introni e dall’altro la saldatura

delle parti corrispondenti agli esoni che possono in questo modo

formare una molecola continua: l’mRNA maturo. In particolare il

processo di rimozione degli introni consiste in una serie piuttosto

complessa di reazioni che coinvolge delle piccole ribonucleo-proteine

nucleari (snRNP). Questi complessi enzimatici in una prima fase

operano un taglio all’estremità 5’ dell’introne in corrispondenza di un

dinucleotide GU e stabiliscono e stabiliscono un legame con un

nucleotide di adenina (A) dal sito di diramazione localizzato all’interno

dell’introne che genera così una struttura circolare a forma di cappio. In

una seconda fase, determinano un taglio , ma all’ estremità 3’

dell’introne in corrispondenza di un dinucleotide AG e saldano

mediante un legame fosfodiesterico i due esoni adiacenti mentre

l’introne rimosso va a incontro a degradazione all’interno del nucleo. Il

meccanismo appena descritto costituisce lo splicing secondo la regola

5’-GU/3’-AG. Negli eucarioti superiori la grande maggioranza dei geni

nucleari contiene almeno uno o due introni a livello di pre mRNA che

vengono rimossi mediante contengono tale meccanismo di splicing

basato sull’azione di un complesso enzimatico costituito da subunità

ribonucleoproteiche , chiamato spliceosoma . nelle piante

occasionalmente alcuni geni strutturali e alcuni geni mitocondriali e

cloroplastici codificanti per il tRNA e rRNA presentano introni che

vengono rimossi mediante un processo di autosplicing. Questo

meccanismo comporta in una prima fase il legame di un nucleotide

libero di guanina a un sito interno dell’introne e il taglio dell’RNA in

corrispondenza dell’estremità 3’ dell’esone adiacente a monte ed in una

seconda fase , il legame di un altro nucleotide di guanina presente

all’interno dell’introne e il taglio dell’RNA in corrispondenza

dell’estremità 5’ dell’esone adiacente a valle. Una sequenza di DNA

risultante segue un codone start e che non è interrotta da un codone

stop costituisce un open roading frame(ORF) oppure modulo di lettura

aperto potenzialmente traducibile in una catena polipepdtidica. La

rimozione degli introni nei geni con introni multipli può avvenire

separatamente (splicing regolare) oppure in combinazione a seconde di

come il macchinario dello splicing interagisce con l’RNA. Ad esempio

qualora due introni successivi vengono rimossi insieme, anche l’esone

compreso tra questi, sarà rimosso. Il processo di maturazione dei pre

mRNA può avvenire secondo uno o più percorsi diversi. Tale

meccanismo è detto splicing alternativo e condiziona la sequenza

amminoacida di una catena polipeptidica, le proteine codificate da uno

stesso gene possono avere strutture e funzioni diversificate.

Approfondimento Codice genetico

Dopo la scoperta dell’mRNa restava tuttavia da stabilire come tale

molecola potesse servire da stampo per disporre nella giusta sequenza

gli amminoacidi nelle relative catene polipeptidiche(traduzione). Era

noto che i ribosomi rappresentassero la sede della sintesi proteica e

che esistesse almeno un tRNA specifico per il trasporto di ciascun

amminoacido e che la sequenza delle basi contenute nell’mRNA venisse

riconosciuta dal tRNA e non dall’amminoacido che trasporta questo.

Nel 1959 Oshoa e collaboratori scoprirono l’enzima polinucleotide

fosforilasi , un RNA polimerasi presente in tutti i batteri , utilizabile per

sintetizzare RNA artificiali. Indeterminate condizioni di reazione, questo

catalizza la formazione del legame fosfodiesterico 5’-3’ tra

ribonucleotidi , sintetizzando polimeri di RNA senza la necessità di un

filamento stampo di DNA ma solamente in funzione della presenza di

ribonucleotidi. La polinucleotide fosfarilasi costituì la chiave per

decifrare il codice genetico poiché permise di produrre RNA

messaggero artificiali con successione casuale di basi e composizione

nota in termini proporzionali e direttamente utilizzabili proteica in vitro

con sistemi acellulari. Un contributo determinante alla decifrazione del

codice genetico fu dato da Gamow il quale propose che ciascun

amminoacido dovesse essere codificato da più di due vasi accoppiate

ed adiacenti . poiché le quattro basi , prese a due a due , producono

soltanto (4x4) 16 combinazioni. Gamow formulò l’ipotesi che ciascun

amminoacido fosse specificato da una sequenza di tre basi lungo la

catena di DNA. Tre basi che nel DNA e nell’RNA si succedono

linearmente costituirebbero quindi un unità di informazione 1 tripletta

-1 unità di informazione-1 amminoacido. Per risolvere la questione

dell’esistenza di 64(4x4x4) possibili triplette a fronte della presenza di

soli 20 amminoacidi, si pensò che molti amminoacidi fossero codificati

da più di una tripletta. Impiegando la polinucleotide fosforilasi , e

utilizzando come precursore solo uridina difosfato, si riuscì a

sintetizzare un polimero di RNA contenete solamente uracile chiamato

poli(U) oppure acido poriudirilico. Tale polmero venne aggiunto a 20

sistemi acellulari di E. coli preventivamente attivati con ATP ciascuno

contenente una miscela di 20 possibili amminoacidi. In ogni miscela

uno dei amminoacidi veniva marcato radioattivamente con 14c mentre

gli altri dicianove non lo erano. Con questi sistemi acellulari fu così

possibile promuovere la sintesi proteica allo scopo di misurare il livello

di radioattività delle proteine prodotte in base all’incorporazione

dell’amminoacido marcato. Tutti i sistemi acellulari consentirono la

sintesi di proteine ma soltanto in uno di questi la proteina risultò

radioattiva : nel sistema acellulare contenente la fenilalanina (Phe)

marcata. L’esperimento permise quindi di stabilire quale amminoacido

venisse incorporato nella proteina codificata dell’RNA poli(U). la

dimostrazione che il codice genentico funziona a triplette fu data nel

1961 da Crick e Brenner operando con un batteriofago, il il fago T4. Con

il loro esperimento ,questi ricercatori dimostrarono che mutazioni

singole consistenti nella perdita(delezione) o nell’aggiunta(inserzione)

di un nucleotide nel DNA, rendevano inoperante il messaggio ereditario

determinando un cambiamento del motivo di lettura e quindi il completo

sfasamento del messaggio. Mutazioni doppie di tipo opposto cioè la

perdita e l’aggiunta di un nucleotide nel DNA (delezione+ inserzione)

potevano invece rimettere a posto il messaggio ereditario nel caso in

cui fossero occorse in posizioni adiacenti lungo il filamento di DNA.

Inoltre fu provato che mutazioni triple nella stessa direzione

corrispondenti alla perdita o aggiunta di tre nucleotidi, consentono il

ritorno in fase del messaggio e il ripristino del motivo di lettura , non

pregiudicando la funzionalità del gene nel caso in cui i cambiamenti

interessino solamente un breve tratto di DNA. In questo modo Crick e

collaboratori poterono affermare che il codice genetico funziona a

triplette e e che l’informazione ereditaria viene letta a partire da un

certo punto della molecola di DNA. Una volta dimostrato che il codice

genetico funziona triplette, i risultati acquisiti con i polimeri contenti

ribonucleotidi con una sola base indicavano quidi che UUU codifica per

fenilalanina AAA per la lisina CCC per prolina e GGG per la glicina. Fu

attraverso una serie di esperimenti ciascuno noto come saggio dei

copolimeri casuali, basato sul confronto tra percentuali di triplette

attese nell’RNA artificiale e percentuali di amminoacidi osservati nella

catena polpeptidica sintetizzata che nel 1966, i gruppi di ricerca

Nirenberg, Khorana e di Ochoa, che completarono la decifrazione del

codice genetico stabilendo l’esatta corrispondenza tra amminoacidi e

triplette codificate. Nel 1964 fu sviuluppato un altro approccio noto

basato su un saggio di legame ai ribosomi, per stabilire la

corrispondenza tra triplette e amminoacidi. In questo caso gli

esperimenti prevedevano la sintesi dim RNA artificiali molto più

semplici costituiti da particolari trinucleotidi ad esempio AAU UUC ACC

GGU , capaci di combinarsi ai ribosomi e di legarsi agli RNA di

trasferimento carichi del corrispondente amminoacido grazie

all’appaiamento specifico codone-anticodone. Le caratterisitiche del

codice genetico possono così essere riassunte: il codice funziona a

triplette, non ha ne segni di interruzione ne segni di sovrapposizione,

cioè è letto in modo successivo a tre nucleotidi per volta senza

interruzioni entro un codone e senza sovrapposizioni tra i codoni.

Tuttavia una sequenza nucleotidica può avere diverse fasi di lettura e

codificare per proteine diverse a seconda del punto di inizio di lettura. Il

codice genetico è universale ma tutti gli organismi viventi condividono

lo stesso codice genetico. Tutti gli amminmoacidi ad eccezione di

meteonina e triptofano ,vengono codificati da più di una tripletta, motivo

per il quale il codice è detto degenerato. Il codice è ordinato poiché le

triplette che codificano per uno stesso amminoacido, hanno in genere i

primi due nucleotidi identici e differiscono solamente per il terzo, fanno

eccezione per questa regola la leucina e la arginina che sono codificati

da sei triplette diverse. Infine il codice genetico ha segnali di inizio e di

fine e ciò significa che nella stessa sequenza di lettura esistono triplette

specifiche che controllano l’inizio e la fine della sintesi proteica. Dei 64

possibili codoni, 61 codificano per amminoacidi e sono chiamati codoni

senso . la tripletta 5’-AUG-3’ all’estremità 5’ dell’mRNA costituisce il

codone start , codificante per l’amminoacido metionina che segnala il

punto di inizio della traduzione. Negli eucarioti esistono in realtà due

tipi di tRNA che legano lo stesso amminoacido ma che hanno una

met

struttura differente: uno è impiegato per la metionina di ini