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Approfondimento Meccanismo di splicing
La maggior parte dei geni nucleari presenta sequenze non codificanti
dette introni che interrompono quelle codificanti. Tali interruzioni sono
definite come sequenze intercalari alle quali è riconosciuta una funzione
regolatrice mentre le sequenze codificanti che si traducono cioè in
proteine, rappresentano gli esoni. Il trascritto primario di mRNA deve
essere reso attivo prima di spostarsi nel citoplasma. Affinchè un RNA
sia funzionale è necessario che i trascritti siano rielaborati all’interno
del nucleo attraverso un meccanismo di splicing per la creazione di
molecole di mRNA attive lo splicing dei pre mRNA implica, da un lato la
sospensione negli mRNA precursori degli introni e dall’altro la saldatura
delle parti corrispondenti agli esoni che possono in questo modo
formare una molecola continua: l’mRNA maturo. In particolare il
processo di rimozione degli introni consiste in una serie piuttosto
complessa di reazioni che coinvolge delle piccole ribonucleo-proteine
nucleari (snRNP). Questi complessi enzimatici in una prima fase
operano un taglio all’estremità 5’ dell’introne in corrispondenza di un
dinucleotide GU e stabiliscono e stabiliscono un legame con un
nucleotide di adenina (A) dal sito di diramazione localizzato all’interno
dell’introne che genera così una struttura circolare a forma di cappio. In
una seconda fase, determinano un taglio , ma all’ estremità 3’
dell’introne in corrispondenza di un dinucleotide AG e saldano
mediante un legame fosfodiesterico i due esoni adiacenti mentre
l’introne rimosso va a incontro a degradazione all’interno del nucleo. Il
meccanismo appena descritto costituisce lo splicing secondo la regola
5’-GU/3’-AG. Negli eucarioti superiori la grande maggioranza dei geni
nucleari contiene almeno uno o due introni a livello di pre mRNA che
vengono rimossi mediante contengono tale meccanismo di splicing
basato sull’azione di un complesso enzimatico costituito da subunità
ribonucleoproteiche , chiamato spliceosoma . nelle piante
occasionalmente alcuni geni strutturali e alcuni geni mitocondriali e
cloroplastici codificanti per il tRNA e rRNA presentano introni che
vengono rimossi mediante un processo di autosplicing. Questo
meccanismo comporta in una prima fase il legame di un nucleotide
libero di guanina a un sito interno dell’introne e il taglio dell’RNA in
corrispondenza dell’estremità 3’ dell’esone adiacente a monte ed in una
seconda fase , il legame di un altro nucleotide di guanina presente
all’interno dell’introne e il taglio dell’RNA in corrispondenza
dell’estremità 5’ dell’esone adiacente a valle. Una sequenza di DNA
risultante segue un codone start e che non è interrotta da un codone
stop costituisce un open roading frame(ORF) oppure modulo di lettura
aperto potenzialmente traducibile in una catena polipepdtidica. La
rimozione degli introni nei geni con introni multipli può avvenire
separatamente (splicing regolare) oppure in combinazione a seconde di
come il macchinario dello splicing interagisce con l’RNA. Ad esempio
qualora due introni successivi vengono rimossi insieme, anche l’esone
compreso tra questi, sarà rimosso. Il processo di maturazione dei pre
mRNA può avvenire secondo uno o più percorsi diversi. Tale
meccanismo è detto splicing alternativo e condiziona la sequenza
amminoacida di una catena polipeptidica, le proteine codificate da uno
stesso gene possono avere strutture e funzioni diversificate.
Approfondimento Codice genetico
Dopo la scoperta dell’mRNa restava tuttavia da stabilire come tale
molecola potesse servire da stampo per disporre nella giusta sequenza
gli amminoacidi nelle relative catene polipeptidiche(traduzione). Era
noto che i ribosomi rappresentassero la sede della sintesi proteica e
che esistesse almeno un tRNA specifico per il trasporto di ciascun
amminoacido e che la sequenza delle basi contenute nell’mRNA venisse
riconosciuta dal tRNA e non dall’amminoacido che trasporta questo.
Nel 1959 Oshoa e collaboratori scoprirono l’enzima polinucleotide
fosforilasi , un RNA polimerasi presente in tutti i batteri , utilizabile per
sintetizzare RNA artificiali. Indeterminate condizioni di reazione, questo
catalizza la formazione del legame fosfodiesterico 5’-3’ tra
ribonucleotidi , sintetizzando polimeri di RNA senza la necessità di un
filamento stampo di DNA ma solamente in funzione della presenza di
ribonucleotidi. La polinucleotide fosfarilasi costituì la chiave per
decifrare il codice genetico poiché permise di produrre RNA
messaggero artificiali con successione casuale di basi e composizione
nota in termini proporzionali e direttamente utilizzabili proteica in vitro
con sistemi acellulari. Un contributo determinante alla decifrazione del
codice genetico fu dato da Gamow il quale propose che ciascun
amminoacido dovesse essere codificato da più di due vasi accoppiate
ed adiacenti . poiché le quattro basi , prese a due a due , producono
soltanto (4x4) 16 combinazioni. Gamow formulò l’ipotesi che ciascun
amminoacido fosse specificato da una sequenza di tre basi lungo la
catena di DNA. Tre basi che nel DNA e nell’RNA si succedono
linearmente costituirebbero quindi un unità di informazione 1 tripletta
-1 unità di informazione-1 amminoacido. Per risolvere la questione
dell’esistenza di 64(4x4x4) possibili triplette a fronte della presenza di
soli 20 amminoacidi, si pensò che molti amminoacidi fossero codificati
da più di una tripletta. Impiegando la polinucleotide fosforilasi , e
utilizzando come precursore solo uridina difosfato, si riuscì a
sintetizzare un polimero di RNA contenete solamente uracile chiamato
poli(U) oppure acido poriudirilico. Tale polmero venne aggiunto a 20
sistemi acellulari di E. coli preventivamente attivati con ATP ciascuno
contenente una miscela di 20 possibili amminoacidi. In ogni miscela
uno dei amminoacidi veniva marcato radioattivamente con 14c mentre
gli altri dicianove non lo erano. Con questi sistemi acellulari fu così
possibile promuovere la sintesi proteica allo scopo di misurare il livello
di radioattività delle proteine prodotte in base all’incorporazione
dell’amminoacido marcato. Tutti i sistemi acellulari consentirono la
sintesi di proteine ma soltanto in uno di questi la proteina risultò
radioattiva : nel sistema acellulare contenente la fenilalanina (Phe)
marcata. L’esperimento permise quindi di stabilire quale amminoacido
venisse incorporato nella proteina codificata dell’RNA poli(U). la
dimostrazione che il codice genentico funziona a triplette fu data nel
1961 da Crick e Brenner operando con un batteriofago, il il fago T4. Con
il loro esperimento ,questi ricercatori dimostrarono che mutazioni
singole consistenti nella perdita(delezione) o nell’aggiunta(inserzione)
di un nucleotide nel DNA, rendevano inoperante il messaggio ereditario
determinando un cambiamento del motivo di lettura e quindi il completo
sfasamento del messaggio. Mutazioni doppie di tipo opposto cioè la
perdita e l’aggiunta di un nucleotide nel DNA (delezione+ inserzione)
potevano invece rimettere a posto il messaggio ereditario nel caso in
cui fossero occorse in posizioni adiacenti lungo il filamento di DNA.
Inoltre fu provato che mutazioni triple nella stessa direzione
corrispondenti alla perdita o aggiunta di tre nucleotidi, consentono il
ritorno in fase del messaggio e il ripristino del motivo di lettura , non
pregiudicando la funzionalità del gene nel caso in cui i cambiamenti
interessino solamente un breve tratto di DNA. In questo modo Crick e
collaboratori poterono affermare che il codice genetico funziona a
triplette e e che l’informazione ereditaria viene letta a partire da un
certo punto della molecola di DNA. Una volta dimostrato che il codice
genetico funziona triplette, i risultati acquisiti con i polimeri contenti
ribonucleotidi con una sola base indicavano quidi che UUU codifica per
fenilalanina AAA per la lisina CCC per prolina e GGG per la glicina. Fu
attraverso una serie di esperimenti ciascuno noto come saggio dei
copolimeri casuali, basato sul confronto tra percentuali di triplette
attese nell’RNA artificiale e percentuali di amminoacidi osservati nella
catena polpeptidica sintetizzata che nel 1966, i gruppi di ricerca
Nirenberg, Khorana e di Ochoa, che completarono la decifrazione del
codice genetico stabilendo l’esatta corrispondenza tra amminoacidi e
triplette codificate. Nel 1964 fu sviuluppato un altro approccio noto
basato su un saggio di legame ai ribosomi, per stabilire la
corrispondenza tra triplette e amminoacidi. In questo caso gli
esperimenti prevedevano la sintesi dim RNA artificiali molto più
semplici costituiti da particolari trinucleotidi ad esempio AAU UUC ACC
GGU , capaci di combinarsi ai ribosomi e di legarsi agli RNA di
trasferimento carichi del corrispondente amminoacido grazie
all’appaiamento specifico codone-anticodone. Le caratterisitiche del
codice genetico possono così essere riassunte: il codice funziona a
triplette, non ha ne segni di interruzione ne segni di sovrapposizione,
cioè è letto in modo successivo a tre nucleotidi per volta senza
interruzioni entro un codone e senza sovrapposizioni tra i codoni.
Tuttavia una sequenza nucleotidica può avere diverse fasi di lettura e
codificare per proteine diverse a seconda del punto di inizio di lettura. Il
codice genetico è universale ma tutti gli organismi viventi condividono
lo stesso codice genetico. Tutti gli amminmoacidi ad eccezione di
meteonina e triptofano ,vengono codificati da più di una tripletta, motivo
per il quale il codice è detto degenerato. Il codice è ordinato poiché le
triplette che codificano per uno stesso amminoacido, hanno in genere i
primi due nucleotidi identici e differiscono solamente per il terzo, fanno
eccezione per questa regola la leucina e la arginina che sono codificati
da sei triplette diverse. Infine il codice genetico ha segnali di inizio e di
fine e ciò significa che nella stessa sequenza di lettura esistono triplette
specifiche che controllano l’inizio e la fine della sintesi proteica. Dei 64
possibili codoni, 61 codificano per amminoacidi e sono chiamati codoni
senso . la tripletta 5’-AUG-3’ all’estremità 5’ dell’mRNA costituisce il
codone start , codificante per l’amminoacido metionina che segnala il
punto di inizio della traduzione. Negli eucarioti esistono in realtà due
tipi di tRNA che legano lo stesso amminoacido ma che hanno una
met
struttura differente: uno è impiegato per la metionina di ini