Biologia molecolare - Polimerase chain reaction

POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)

-E’ UNA PROCEDURA PER OTTENERE IN

GRANDE QUANTITA’ UNA SPECIFICA

SEQUENZA DI DNA IN VITRO

-QUESTA TECNICA PUO’ AMPLIFICARE UN

TRATTO DI DNA PER PIU’ DI UN MILIONE DI

VOLTE

ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:

1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A

DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI

OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA

REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE

2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE

DA AMPLIFICARE

3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE

DENATURATA SE PORTATA A 95° C)

4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI

PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO

DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:

1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO

VIENE DENATURATO

2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO

CON IL DNA STAMPO

3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL

FUNZIONAMENTO DI Taq (Termus aquaticus)

POLIMERASI PCR

PCR

VANTAGGI:

• Sensibilita’

• Rapidita’

• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high

throughput)

• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo

stesso campione

• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi

strani, o fissato

SVANTAGGI:

• Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)

• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della

sequenza

• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare

e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco

(primers)

• Può sintetizzare frammenti relativamente corti

• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza(la

Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)

Cella elettroforetica per gel di agarosio

Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di

diversa lunghezza tramite elettroforesi

DNA ale

genomico t -

to A

N

A mR

RN

M E6 E4

10

9

8

7

6 28S

5

4

3 18S

2

DNA satellite 1 7S +

DNA satellite

Unità da 5 a 200 bp.

Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi

Trasferimento secondo Southern

(Southern blot)

SOUTHERN BLOT

Altra forma di ibridazione su membrana: il dot blot

(sia con campioni di RNA che di DNA)

A B C D

   

1    

2    

3    

4 Dot blot