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Rivelatore a indice di rifrazione Il rivelatore a indice di

rifrazione misura la differenza

nell’indice di rifrazione tra la

cella del campione e una cella

di riferimento che

generalmente contiene

soltanto l’eluente. Si utilizza

un fascio di luce collimato e

filtrato per rimuovere la luce

IR che riscalderebbe il

campione. Quando l’eluente

contenente l’analita entra

nella cella del campione, il

Vantaggi e svantaggi raggio viene deflesso e inviato

al fotodiodo producendo un

È un rivelatore universale, cioè risponde a tutti i segnale in uscita differente

composti. Si utilizza per analiti che non assorbono in rispetto a quello prodotto dal

UV (es. idrocarburi saturi, alcool, eteri) solo eluente.

Svantaggi: è poco sensibile, non è compatibile con

gradiente di eluizione ed è sensibile a variazioni di p e

T. l

Rivelatore UV a fissa

La radiazione proveniente da una Vantaggi e svantaggi

lampada a vapori di Hg passa

attraverso la cella del campione e Il principale vantaggio è il basso costo.

arriva al fotodiodo. Inoltre l’elevata intensità della radiazione

della lampada a Hg permette di ottenere

L’intensità della luce assorbita è elevata sensibilità per composti che

proporzionale alla concentrazione assorbono a 254 nm.

dell’analita. Il principale svantaggio è determinato dalla

scarsa selettività dovuta alla necessità di

l

lavorare a fissa. l

Il rivelatore UV a variabile è

sicuramente quello

maggiormente utilizzato in HPLC.

La luce UV proveniente dalla

lampada a D e scissa nelle sue

2

componenti attraverso un

monocromatore a gradini.

L’intensità della luce trasmessa è

misurata attraverso un fotodiodo

ed è proporzionale alla

concentrazione dell’analita

Vantaggi l

- Versatilità: possibilità di selezionare da 190 a 800 nm.

l

- Elevata sensibilità: potendo scegliere la ottimale (max assorbanza) per un

analita.

- Selettività: quando si hanno sovrapposizioni di picchi si può variare la l in modo

tale da minimizzare l’assorbimento degli interferenti. l

- Possibilità di utilizzare gradiente di eluizione, scegliendo una alla quale la miscela

solvente non assorbe.

Rivelatore UV a diode array l

Il rivelatore UV a diode array è

quello che attualmente viene sempre

più utilizzato in HPLC.

La luce UV proveniente dalla lampada

a D passa attraverso una cella a

2

flusso prima che venga scissa nelle

sue componenti attraverso un

monocromatore a gradini. L’intensità

l

della luce trasmessa ad ogni è

misurata simultaneamente attraverso

un array di alcune centinaia di

fotodiodi. Un pc può processare,

registrare e mostrare gli spettri in

continuo durante l’analisi. Inoltre si

possono registrare i cromatogrammi a

l.

ciascuna

Vantaggi e svantaggi l

Presenta gli stessi vantaggi in termini di versatilità, sensibilità e selettività del rivelatore a

variabile. Fornendo anche gli spettri degli analiti, permette di effettuare anche il

riconoscimento dei composti analizzati. l

Svantaggio: è più costoso rispetto al rivelatore a variabile.

Rivelatore a Fluorescenza La luce UV proveniente da una lampada (filtrata

alla opportuna λ) o da un laser, passa attraverso

la cella a flusso. Quando un campione

fluorescente passa attraverso la cella, assorbe la

radiazione, viene eccitato e quindi emetterà la

radiazione di fluorescenza ad una maggiore λ.

L’intensità della luce emessa viene misurata

attraverso un fotomoltiplicatore posto a 90°

rispetto al fascio incidente.

Vantaggi e svantaggi

È un rivelatore molto sensibile, ma risponde soltanto ai pochi analiti fluorescenti. Per

marker

aumentarne l’applicabilità si possono legare covalentemente dei fluorescenti.

Questa derivatizzazione può essere fatta o prima della separazione o post-colonna

aggiungendo i reattivi marcanti tra la colonna e il rivelatore.

Cromatografie di ripartizione

• Fase diretta (fase staz. polare, eluente apolare)

• Fase inversa (fase staz. apolare, eluente polare)

– –

Si O C H

18 37

– –

RPC Eluizione in gradiente acqua CH CN

3

Gel filtrazione

• L’interazione avviene tra la proteina

e la matrice polimerica.

• La matrice polimerica è fatta di

microsfere con porosità controllata.

• Le proteine interagiscono con i pori

delle microsfere e vengono

trattenute in base alla loro

dimensione.

• Se una proteina, molto grande, non

interagisce con la matrice esce con

un volume di eluente pari al Void

Volume (volume vuoto).

Gel filtrazione

Gel filtrazione

  

V V K V

R M R S

Gel filtrazione

• Vantaggi

– Semplice

– Prevedibile

• Svantaggi

– Bassa capacità (piccoli volumi)

– Soluzioni non viscose

Gel filtrazione

Determinazione peso

molecolare

Una proteina

sconosciuta

eluisce a

170 mL: 40,000 Da (40KDa)


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29

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AUTORE

Atreyu

PUBBLICATO

+1 anno fa


DESCRIZIONE DISPENSA

La dispensa fa riferimento alle lezioni di Tecniche di laboratorio biomedico, tenute dal Prof. Franceschini Nicola, nell'anno accademico 2011.
Il documento è dedicato alla tecnica cromatografica.
Tra gli argomenti affrontati: schema a blocchi, pompa alternativa a pistone, valvole di iniezione, colonne, infiltrazioni.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie
SSD:
Università: L'Aquila - Univaq
A.A.: 2011-2012

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Atreyu di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di TECNICHE DI LABORATORIO BIOMEDICO e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università L'Aquila - Univaq o del prof Franceschini Nicola.

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