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Cosa determina l’assorbanza di un cromoforo?

•I cromofori sono di solito caratterizzati da doppi legami e sistemi di

risonanza

•Lo spettro di assorbimento di un cromoforo è solo parzialmente

determinato dalla sua natura chimica

•L’ambiente del cromoforo influenza le proprietà dello spettro

pH

• polarità del solvente

• Effetti di orientamento

•I cromofori possono agire da che possono dare informazioni

molecole reporter

circa il loro ambiente .

•Effetti di protonazione/deprotonazione dovuti a cambiamenti di pH o effetti di

ossidazione/riduzione influenzano la distribuzione elettronica dei cromofori

• polarità del solvente. Gli spettri cambiano in differenti solventi.

• Effetti di orientamento derivano da molecole di cromofori vicini.. E.g.

hyperchromicity degli acidi nucleici.

nucleici

Un’estesa coniugazione ha un grande

λ ; lo spostamento sarà a

effetto sulla max

lunghezze d’onda maggiori

H

H H H 1,3-butadiene

C C

C C H

H

H H C C H

H

λ λ

170 nm 217 nm

max max

H H

C C H λ 217 nm

H max

C C (

(diene coniugato)

g )

H

H

H C H

3 C λ

C H 263 nm

max

triene coniugato

H H

C C

H C C CH

H 3

Licopene

È il pigmento

i t rosso-

rosso -arancio

i d

del

l pomodoro

d

λ 505 nm

max

•Gli

Gli spettri

i di assorbimento

bi sono misurati

i i tramite

i spettrofotometri

f i

o

I I

Light

i Cuvette

source Monochromator containing

Sample

p Detector

MONOCROMATORE

È noto che q

quando un raggio

gg di luce bianca colpisce

p un p

prisma di vetro viene scomposto

p in

diversi colori. Quello che accade è analogo a quanto si osserva nell'arcobaleno o guardando

obliquamente la superficie di un CD.

La scomposizione (dispersione) in diversi colori

tramite un prisma si spiega in quanto:

• la luce “bianca” è in realtà un miscuglio di

radiazioni di diversa frequenza

q e q

quindi

corrispondenti a tutti i colori;

• quando un raggio di luce passa da un mezzo ad

un altro viene deviato (fenomeno detto

“rifrazione”):

rifrazione ): l

l'entità

entità della deviazione dipende dalla

lunghezza d'onda del raggio incidente.

Una radiazione di un solo colore ottenuta tramite dispersione, caratterizzata da una ben

precisa lunghezza d'onda e frequenza, viene detta fascio di luce MONOCROMATICA.

Si parla invece di fascio di luce POLICROMATICA quando esso è costituito da radiazioni di

frequenza e lunghezza d'onda diverse. La luce bianca proveniente dal sole è policromatica.

Per sapere se un fascio di luce è monocromatico o policromatico è sufficiente farlo passare

attraverso un prisma: se il raggio rimane unico si può dire che è monocromatico; se invece

è policromatico, viene scomposto in diversi raggi.

Aspetti sperimentali

Schema di uno spettrofotometro a doppio raggio

Spettrofotometro a doppio raggio

Aspetti sperimentali

MONOCROMATORE

ECCITAZIONE

λ EXC

SORGENTE ATORE

Schema a blocchi di uno NOCROMA EM

spettrofluorimetro ISSIONE λ

MO EM RIVELATORE (TUBO

FOTOMOLTIPLICATORE)

T=I/I

0

A=log1/T = log I /I

0

ε

A = cd

λ

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Path length / cm 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

%T 100 50 25 12.5 6.25 3.125

Absorbance 0 03

0.3 06

0.6 09

0.9 12

1.2 15

1.5

c

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla profondità, d

Assorbimento

0.82 Sorgente di luce

Rivelatore La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla profondità, d

0.62 Sorgente luminosa

b

Rivelatore Campione

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla profondità, d

Assorbimento

0.42 Sorgente

Rivelatore campioni

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla profondità, d

Assorbanza

0.22 Sorgente

Rivelatore Campioni

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla concentrazione, c

Assorbanza

0.82 Sorgente

Rivelatore

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla concentrazione, c

Assorbanza

0.62 Sorgente

b

Rivelatore Campione

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla concentrazione, c

Assorbanza

0.42 Sorgente

b

Rivelatore campione

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ

Assorbanza

0.82 Sorgente

Rivelatore

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ

Assorbanza

0.30 Sorgente

b

Rivelatore

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ

Assorbanza

0.80 Sorgente

b

Rivelatore

La legge di Lambert-Beer

ε

A = cd

λ

Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ

Assorbanza

0.35 Sorgente

b

Rivelatore

Determinazione dei coefficienti di

ti i l

estinzione molare

delle

d ll proteine

t i possono essre stimati

ti ti sulla

ll

Ι ε

valori

l i di

base della composizione aminoacidica

(280 ) = # of

f Trp’s

T ’ x 5500 +

ε(280nm) # of Tyr’s x 1490 +

# of

f di

disulfides

lfid x 125 (

(-S-S-)

S S )

p

predizioni:

http://ca.expasy.org/tools/protparam.html

I valori teorici di sono accurati

ε

)

-1 100000

m

c

-1 75000

(M

mental 50000

perim 25000

ex 0

ε 0 50000 100000

-1 -1

ε cm )

predicted (M

Però…

Però

• NADH libero o legato ha assorbimenti

(ε) diversi

• Si può “titolare” il sito dell’enzima

ΔA

misurando

i d

Spettri differenziali e perturbazioni del solvente

Cambiamenti nella lunghezza d’onda della banda di assorbimento

possono essere indicativi di cambiamenti nella struttura.

L

L’uso

uso di denaturanti o diversi solventi può essere utile per ottenere

informazioni sulla struttura della proteina, e studiare i suoi

cambiamenti conformazionali

Spettroscopia differenziale

Glycerol

DMSO Glycerol

E sucrose

or

A DMSO

λ Protein

nativa

Urea

E A292

or

A 30 40 50 60

temp

•Spettri di proteine native o

λ denaturate possono essere usati per

studiare le cinetiche di

denaturazione/rinaturazione

0.01M

NaCl 0.1M

292 •La stabilità delle proteine in diversi

A NaCl tamponi può essere studiata in diversi

tamponi misurando il suo unfolding

in funzione della temperatura

30 40 50 60

temp

• Se il prodotto di una reazione è un cromoforo

cromoforo, è possibile usare la

spettroscopia di assorbimento elettronico per studiare la cinetica

enzimatica

A tempo

OH O-

pH 6 pH 13

CH

2 CH

2

+

CH NH

A 3 CH NH

2

250 270 290 310 330

λ

• Effetti di protonazione deprotonazione


PAGINE

79

PESO

2.78 MB

AUTORE

Atreyu

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie
SSD:
Università: L'Aquila - Univaq
A.A.: 2011-2012

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Atreyu di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di TECNICHE DI LABORATORIO BIOMEDICO e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università L'Aquila - Univaq o del prof Franceschini Nicola.

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