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 Piccole quantità di contaminanti possono essere tollerate, a

seconda delle indagini che si desidera effettuare sulla proteina

di interesse

 Gradi di purezza del 95% - 98% sono sufficienti per la maggior

parte delle analisi sperimentali

 Alcuni tipi di analisi, quali la determinazione della struttura

mediante cristallografia, richiedono campioni proteici

particolarmente puri

INVESTIGATORI DELLA CIA BIOCHIMICI

OBIETTIVO: catturare un terrorista OBIETTIVO: purificare una proteina

I FASE: INDAGINI I FASE: RICERCA BIBLIOGRAFICA

DOMANDE: DOMANDE:

1. Quali informazioni abbiamo? 1. Quali informazioni abbiamo?

2. Come si chiama e che aspetto ha? 2. Quali sono le caratteristiche della proteina?

3. Di cosa si occupa? 3. Quali funzioni svolge nella cellula?

4. Quali ambienti frequenta? 4. Dove è presente in elevate quantità?

5. Ha guardie del corpo? 5. Quali difficoltà ci aspettiamo di incontrare?

6. Ha sosia?

II FASE: preparazione del piano di cattura II FASE: scelta della procedura

DOMANDE: DOMANDE:

1. Lo vogliamo vivo o morto? 1. Qualità o quantità?

2. Analisi del territorio 2. Identificazione della fonte

3. Quanti uomini sono necessari? 3. Scelta dei passaggi

FASE OPERATIVA FASE OPERATIVA

• •

Circondare la zona e costringerlo ad uscire Preparazione del campione di partenza

• •

Isolamento dal gruppo (escludere i sosia) Isolamento e purificazione

• •

Arresto ed interrogatorio Caratterizzazione

Ogni passaggio della procedura di purificazione determina la separazione delle

proteine totali presenti nel campione in una serie di frazioni (frazionamento).

Per ciascuna frazione è determinata la quantità di proteine totali e le unità di

attività enzimatica della proteina di interesse.

Una unità enzimatica (U) è definita come la quantità di enzima richiesta per convertire

1 µmol di substrato in prodotto in 1 min in condizioni definite (generalmente 25 o

°C,

30 ad un valore di pH ottimale).

mg o U di proteina di interesse nella frazione

RESA mg o U di proteina di interesse nella preparazione originale

Il grado di purezza di un enzima in una particolare frazione è espresso tramite

l’attività la quale pone in relazione l’attività enzimatica totale con il

specifica,

contenuto totale di proteine presenti nella preparazione.

ATTIVITA’ U di enzima di interesse nella frazione

SPECIFICA mg di proteine totali nella frazione

Nel corso di una purificazione ottimale

la resa diminuisce e

l’attività specifica aumenta

proteine Enzima Resa Purezza U totali A s

totali (mg) % (%) (U/mg)

(mg)

Omogenato 1000 100 100% 10% 10000 10

1° stadio di 100 50 50% 50% 5000 50

purificazione

2° stadio di 27 25 25% 92% 2500 92

purificazione

3° stadio di 20 19.8 19.8% 99% 1980 99

purificazione Valore ipotetico

Saggio Stima da Saggio di proteina pura =

colorimetrico SDS-PAGE attività 100 U/mg

enzimatica

La messa a punto di un procedimento sperimentale di purificazione di una proteina

richiede la possibilità di:

1. Identificare e quantizzare la proteina di interesse fra tutte le altre proteine

del campione di partenza (gli ENZIMI possono essere identificati sulla

base della reazione che essi catalizzano tramite un opportuno SAGGIO

ENZIMATICO)

2. Misurare la quantità di proteine totali nel campione

3. Valutare la presenza di proteine contaminanti nel campione di interesse

Identificare e quantizzare la proteina di interesse fra

tutte le altre proteine del campione di partenza

 E’ necessario disporre di un opportuno saggio che consenta di

seguire la proteina durante i vari passaggi del procedimento

di purificazione

 E’ importante che il saggio disponibile sia eseguibile

rapidamente su molti campioni

 Il saggio deve indicare in maniera affidabile la quantità della

proteina desiderata presente ai vari stadi di purificazione

 Inoltre il saggio deve essere eseguibile con una piccola quantità

di campione proteico

Specifico

Quantitativo Gruppo di enzimi che

catalizzano l’idrolisi

di monoesteri del fosfato

FOSFATASI

32- 32-

R-O-PO + H O R-O-H + HO-PO

2 NO

NO 2

2 FOSFATASI

32- 32-

-PO + H O -H + HO-PO

O

O 2

p-nitrofenil-fosfato p-nitrofenolo

INCOLORE GIALLO

Le reazioni che richiedono nucleotidi piridinici sono molto

usate nei metodi enzimatici di analisi.

Tali coenzimi (NAD, NADH, NADP, NADPH) sono ideali

perché sono usati stechiometricamente in un gran numero

di reazioni di ossido-riduzione.

+

Composto ridotto + NAD Composto ossidato + NADH

NAD+ NADH

(non assorbe a 340 nm) (assorbe a 340 nm)

Saggio enzimatico non specifico, dal momento che evidenzia

+

tutti gli enzimi che usano come coenzima il NAD .

proteine Enzima Resa Purezza U totali A s

totali (mg) % (%) (U/mg)

(mg)

Omogenato 1000 100 100% 10% 10000 10

1° stadio 5000

purificazione

2° stadio 2500

purificazione

3° stadio 1980

purificazione Valore ipotetico

Stima da

Saggio Saggio di proteina pura = 100

SDS-PAGE

colorimetrico attività U/mg

enzimatica

Cuvetta contenente il

campione di proteina

l a concentrazione C

I

I 1

0 Rivelatore

Sorgente I 0

Quando si fa passare una luce di una particolare lunghezza d’onda λ attraverso un

percorso l di una soluzione di concentrazione definita, una certa proporzione della

luce è assorbita dalla soluzione.

Se l’energia della luce incidente è e l’energia della luce trasmessa (dopo essere

I

0

passata attraverso la soluzione) è I , allora la frazione di luce trasmessa è I /I ,

1 1 0

nota come trasmittanza T.

Se T = 100%, la sostanza è trasparente.

Se T = 0%, la sostanza è opaca ed assorbe completamente la luce.

L’assorbanza di una soluzione è direttamente proporzionale alla concentrazione del

materiale assorbente quando il percorso della luce è mantenuto costante.

εcl

A = log (I /I ) =

10 0 1 coefficiente di

estinzione

L’assorbanza è adimensionale.

Quando la concentrazione è espressa in molarità (M) ed il percorso della luce in centimetri

ε -1 -1

(cm), è noto come coefficiente di estinzione molare (M cm ) di un dato composto.

ε è l’assorbanza a 280 nm di una soluzione allo 0.1% (1 mg/ml) della sostanza in

0.1%280nm

esame (ad es. una proteina) in una cuvetta lunga 1 cm.

 La concentrazione delle proteine può essere stimata misurando l’assorbanza

delle soluzioni contenenti le proteine a 280 nm (UV)

 Il metodo è adoperato comunemente perché non distrugge il campione ed è

molto rapido

 La maggior parte delle proteine ha un massimo di assorbimento a 280 nm per

la presenza degli amminoacidi aromatici triptofano (W), tirosina (Y) e

fenilalanina (F)

 Poiché la composizione in amminoacidi delle proteine varia notevolmente,

l’assorbimento molare varierà anch’esso di molto, a seconda del contenuto

di questi amminoacidi

Proteine che non contengono W, Y e F non avranno un massimo di assorbimento a 280

nm, mentre proteine che contengono molti residui di W, Y e F avranno elevati valori di

assorbimento molare, con un massimo di assorbimento a 280 nm.

Il metodo non è quindi molto accurato a meno che la proteina sia pura e ne sia noto

l’assorbimento molare.


PAGINE

33

PESO

15.07 MB

AUTORE

Atreyu

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie
SSD:
Università: L'Aquila - Univaq
A.A.: 2011-2012

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Atreyu di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di TECNICHE DI LABORATORIO BIOMEDICO e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università L'Aquila - Univaq o del prof Franceschini Nicola.

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