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ISTRUZIONI PER L'USO DEL MICROSCOPIO OTTICO

1) Collocare il vetrino sul tavolino portavetrini; 2) inserire l'obbiettivo 10 X

(piccolo); 3) centrare la sezione affinché sia in asse con l'obbiettivo; 4) mettere a

fuoco muovendo lentamente la vite macrometrica, aggiustando poi con la vite

micrometrica; 5) cambiare obbiettivo (medio 20 X o

grande 40 X) mettendo a fuoco solamente

con la vite micrometrica; 6) ruotando la vite

del condensatore si può aumentare la

luminosità o il contrasto dell’immagine; 7)

accertarsi che la fonte luminosa sia nella

giusta posizione (e non sia ruotata

lateralmente). N.B. L'ingrandimento totale

si calcola moltiplicando il valore

dell'ingrandimento scritto sull'oculare per

quello scritto sull'obbiettivo.

Microscopio ottico

a luce bianca

ALLESTIMENTO DI PREPARATI ISTOLOGICI

La preparazione di una sezione istologica richiede diverse tappe:

01) Fissazione

Il prelievo appena prelevato dall'organo che si desidera esaminare, deve essere

fissato mediante un liquido fissativo. I più usati sono la formalina (formaldeide al

4%); la paraformaldeide al 4%; la glutaraldeide; il tetrossido di Osmio (per la

stabilizzazione dei lipidi); la miscela di Bouin (soluzione di formalina, acido

picrico e acido acetico glaciale), la miscela di. Carnoy (soluzione di alcol assoluto,

acido acetico glaciale e cloroformio). La fissazione serve a bloccare le attività

vitali della cellula, rendendo insolubili i componenti strutturali, stabilizzando le

proteine e inattivando gli enzimi idrolitici.

02) Lavaggio

Per togliere il fissativo in eccesso (possibilmente in soluzione tampone fosfato

salino).

03) Disidratazione

Mediante la scala ascendente degli alcoli (alcool etilico a 70°-80°-90°-100°) per

eliminare la componente acquosa, che non permetterebbe l'entrata della paraffina

nel tessuto (l'acqua non é un solvente della paraffina).

Diafanizzazione

04) In solventi della paraffina (ad esempio toluolo, benzolo, xilolo) che rendono il

pezzo, già privato dell'acqua, diafano (trasparente) e penetrabile da parte della

paraffina (lo xilene permette la sostituzione dell’alcool assoluto non miscibile con

la paraffina).

Iinfiltrazione

05) In paraffina fusa a 60°C (in stufa, tarata secondo il punto di fusione della

paraffina, fra i 58°C e 60°C) per permetterle di sostituirsi allo xilene, all'interno

del pezzo istologico.

Inclusione

06) In paraffina all'aria (temperatura ambiente), in modo che questa solidifichi -

intorno ed all’interno del prelievo. La durezza della paraffina solida ci permette di

realizzare le sezioni istologiche. Il blocchetto di paraffina é poi montato su

supporto solido per permettere l’affettatura.

Taglio

07) µm.Le

Con il microtomo per paraffina (a slitta o rotativo) in sezioni sottili di 4-8

sezioni vengono distese sull’acqua distillata alla temperatura di circa 40-45°C e

poi fatte aderire al vetrino portaoggetti.

2

Microtomo a slitta per paraffina. Bagnetto stendifette.

L’adesione avviene in stufa a 37°C.

Le sezioni in paraffina aderenti sui vetrini portaoggetto, affinchè possano essere

colorate con coloranti istologici (quasi sempre in soluzioni acquose), debbono prima

subire i seguenti passaggi;

Deparaffinazione

08) Con toluolo, o xilene per allontanare la paraffina dalla sezione istologica;

Reidratazione

09) Con la scala discendente degli alcoli (per ridare gradualmente acqua alla sezione);

Lavaggio

10) Con acqua distillata

Colorazione

11) Viene eseguita la colorazione desiderata (vedi pag. 1-2).

Eseguita l'operazione di colorazione dei preparati, le sezioni sono sottoposte a:

12) Disidratazione

Mediante la scala ascendente degli alcoli (alcool etilico a 70°-80°-90°-100°).

Chiarificazione

13) In solventi organici (toluolo o benzolo o xilene);

Montaggio

14) Con un vetrino coprioggetto con interposta una goccia di alcune resine naturali (ad

es. Balsamo del Canadà), o sintetiche (Eukitt), che hanno lo stesso indice di

rifrazione del vetro. 3

SCHEMA DI INCLUSIONE IN PARAFFINA DI UN FRAMMENTO

D'ORGANO O DI TESSUTO

N.B.: i tempi qui sotto riportati sono puramente indicativi e in ogni caso, va

tenuto ben presente che essi possono variare in funzione delle dimensioni dei

pezzi trattati.

del frammento d’organo o di tessuto;

1) PRELIEVO : in formalina al 10% tamponata (concentrazione pari a13,7%) 10

2) FISSAZIONE

minuti; : in acqua corrente alcuni minuti;

3) LAVAGGIO : nella serie ascendente degli alcoli: etanolo 70° 1 min.; etanolo

4) DISIDRATAZIONE

80° 1 min.; etanolo 90° 10 min.; etanolo assoluto I 5 min.; etanolo assoluto II 10

min.; xilolo I 7 min.; xilolo II 7 min.;

: in paraffina liquida, a 60°C 15 min. 2 volte;

5) INFILTRAZIONE X

: confezione del blocchetto di paraffina solidificata.

6) INCLUSIONE

SCHEMA DI ESECUZIONE DI COLORAZIONI ISTOLOGICHE

1) Sparaffinazione e reidratazione delle sezioni:

Xilolo I 7 min.

Xilolo II 7 min.

Etanolo assoluto I 5 min.

Etanolo assoluto II 5 min.

Etanolo 90 °C 5 min.

Etanolo 80 °C 5 min.

Etanolo 70 °C 5 min.

0 distillata Lavaggio

H

2 4

2) Ematossilina-Eosina:

Ematossilina 10 min.

H20 di fonte 10 min.

Eosina 2-4 min.

H20 distillata Lavaggio

3) Disidratazione:

Etanolo 70°C 5 min.

Etanolo 80°C 5 min.

Etanolo 90°C 5 min.

Etanolo assoluto I 5 min.

Etanolo assoluto II 5 min.

4) Chiarificazione:

Xilolo I 7 min.

Xilolo II 7 min.

5) Montaggio:

in balsamo del Canada

o resine sintetiche.

A) Blu di Toluidina

Porre i vetrini reidratati alcuni minuti nel tampone al pH prescelto (buffer Mc

Ilvaine = acido citrico 0,1 M, Na2HPO4 0,2 M, pH 4).

Immergere in Blu di Toluidina per 10 min.

Lavare in tampone a pH prescelto.

Differenziare in alcol isopropilico (o isobutilico) per 1 min. alzando e abbassando

il vetrino per evitare la formazione di bolle d'aria.

Immergere in xilolo per 1 min. (alzando e abbassando il vetrino).

Montare direttamente in balsamo del Canada.

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PAGINE

12

PESO

1.42 MB

AUTORE

Atreyu

PUBBLICATO

+1 anno fa


DESCRIZIONE DISPENSA

Materiale didattico per il corso Integrato di ISTOLOGIA, canale A + B, Facoltà di Medicina & Chirurgia, DOCENTI: Prof.ssa Maria Bodo - Prof. Ennio Becchetti, riguardante i seguenti argomenti: il microscopio ottico, istruzioni per l'uso; allestimento di preparati istologici; schema di esecuzione di colorazioni istologiche; tecnica veloce al criostato; colorazioni istochimiche.


DETTAGLI
Esame: ISTOLOGIA
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (ordinamento U.E. - 6 anni) (PERUGIA, TERNI)
SSD:
Docente: Bodo Maria
Università: Perugia - Unipg
A.A.: 2011-2012

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Atreyu di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di ISTOLOGIA e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Perugia - Unipg o del prof Bodo Maria.

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