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Fissativi coagulanti

Cloruro mercurico

HgCl 2

- Molto tossico, è detto sublimato corrosivo

- Si usa in soluzione acquosa al 7%, ma anche in miscela con

l’acido acetico, formando il sublimato acetico

- buon stabilizzatore proteico

-E’ un forte ossidante perché l’anione HGCl , liberatosi

2=

dall’idrolisi, si lega ai gruppi NH2 ed SH delle proteine, formando

ponti crociati

- Altera lievemente il citoplasma e la morfologia di alcuni organuli

- penetra rapidamente ma poco profondamente, quindi usato per

campioni molto piccoli (qualche mm di diametro)

Fissativi coagulanti

Triossido di cromo

CrO 3

- Usato in soluzione acquosa 0,5-1 %, in cui si formano acido cromico

(H CrO ), ioni bicromato (Cr O =) e cromato acido (HCrO ).

-

2 4 2 7 4

- E’ il più ossidante fra i fissativi e fissa tutte le proteine bloccando i

gruppi COOH, quindi limita in parte l’azione dei coloranti basici.

- Precipita il DNA e converte gli zuccheri in aldeidi.

- Scarsamente penetrante, ma ottimo per nucleo e cromosomi.

- Buone miscele con cloruro mercurico, tetrossido di osmio ed acido

acetico, ma non con etanolo e formaldeide, con i quali reagisce.

Fissativi coagulanti

Acido picrico (2,4,6-trinitrofenolo)

- esplosivo, in forma di cristalli gialli, usato in soluzione

acquosa al 1-2 %

- eccellente stabilizzatore proteico, con cui forma PICRATI

- non scioglie i lipidi

- non indurisce molto ma coarta i tessuti, per cui spesso

viene usato in miscela con acido acetico, che ne previene

questo effetto

- conferisce un caratteristico colore giallo

Fissativi NON coagulanti H-CHO

Formaldeide

E’ il fissativo più usato. In forma di gas, ma usata come soluzione

acquosa 4-10%, usata singola o in miscele (FORMALINA)

- elevato grado di penetrazione, fissa le proteine e non dissolve i lipidi

- non provoca un indurimento eccessivo dei tessuti, è possibile

mantenere per varie ore i preparati immersi

- per la buona ruscita delle colorazioni successive, è opportuno

neutralizzare la formalina usata nelle miscele aggiungendo una goccia

di rosso neutro 1-2% e poi un eccesso di carbonato di calcio

- molto tossica per le mucose nasali e per gli occhi, quindi necessita di

precauzioni particolari per il suo impiego. OsO

Tetrossido di osmio 4

- Cristalli gialli, molto tossico. Va conservato al buio e al fresco, per

prevenire la sua riduzione. Penetra molto lentamente e rende il

tessuto molto friabile per il sezionamento. Fissa bene le proteine, con

le quali reagisce bloccando i gruppi NH2, non precipita il DNA e forma

un composto nero con i lipidi, quindi è molto buono per evidenziare le

membrane. E’ il fissativo per eccellenza della microscopia elettronica.

Fissativi NON coagulanti K Cr O

Bicromato di potassio 2 2 7

- Usato sempre in è in forma di cristalli giallo-rossi e si usa

miscele,

in soluzione al 10%.

- Produce gli stessi ioni prodotti dal triossido di cromo.

- Spiccata affinità per i fosfolipidi di membrana, rendendo i

fosfolipidi insolubili ai solventi per i lipidi, quindi molto usato per i

mitocondri. Dopo la fissazione, lavaggi molto prolungati per evitare

la formazione di precipitati insolubili di ossido di cromo.

CH3-COOH

Acido acetico

- Usato sempre in miscele.

- Viene chiamato “glaciale”, perché solidifica a 17 °C

- Ha un eccellente potere di penetrazione

- Fissa molto bene i nuclei, ma non coagula le proteine, né fissa o

solubilizza i lipidi.

- Non indurisce il tessuto.

Fissazione MISCELE DI FISSAZIONE

Liquido di Bouin

- miscela più utilizzata

- acido picrico 15, formalina 5, acido acetico 1

- molto penetrante

- usato anche per pezzi voluminosi

Liquido di Carnoy

- usato per fissare cellule isolate

- etanolo 6, cloroformio 3, acido acetico 1

Liquido di Zenker

- buona penetrabilità

Lavaggio

I lavaggi devono essere effettuati in acqua corrente

Eccezioni: fissazione con acido picrico o bicromato di

potassio Scopo:

ELIMINARE L’ECCESSO DI FISSATIVO RIMASTO

ALL’INTERNO DEI CAMPIONI, CHE POTREBBE

REAGIRE CON I COLORANTI SUCCESSIVI

Procedura:

I contenitori immersi direttamente sotto il flusso

(per i campioni piccoli, i contenitori devono avere un

coperchio forato, per impedire che si perdano)

Disidratazione

I campioni devono essere inclusi in resine particolari

che induriscono, permettendo il sezionamento.

Queste resine sono IDROFOBICHE, quindi non sono in

grado di infiltrare il campione, che contiene acqua

DISIDRATAZIONE

Sostituzione graduale dell’acqua con etanolo,

che non provoca coartazione dei campioni

Disidratazione

UTILIZZO DI CONCENTRAZIONI CRESCENTI DI

ETANOLO in acqua

ETANOLO 70%

ETANOLO 80%

ETANOLO 90%

ETANOLO 95%

ETANOLO 100% (per 2 volte)

- I tempi di trattamento sono variabili a seconda delle

dimensioni del campione

- Consigliabile non superare le 2 ore totali

(altrimenti eccessivo indurimento)

- leggera agitazione dei contenitori durante il

trattamento

Chiarificazione

L’agente disidratante (etanolo 100%) non è

miscibile con le resine per l’inclusione

Sostituzione dell’etanolo con un agente intermedio,

che sia miscibile sia con l‘etanolo che con le resine

CHIARIFICAZIONE

(gli agenti intermedi schiariscono il campione,

rendendolo trasparente)

Chiarificazione

AGENTI CHIARIFICANTI

XILOLO

rapida sostituzione, forte indurimento

TOLUENE

rapida sostituzione, medio indurimento

BENZOLO

CLOROFORMIO

lenta sostituzione, basso indurimento

Procedura

ETANOLO/XILOLO 50% - 50%

XILOLO 100%

Inclusione

Lo scopo dell’inclusione è ottenere campioni duri per il

sezionamento PARAFFINA

INFILTRAZIONE IN

- Miscela di idrocarburi saturi di PM elevato, insolubile

in acqua e alcool

- Solida a T ambiente, liquida tra 35-70°C (56-58 °C)

1) Scioglimento a 58°C

2) Filtrazione per eliminare impurità

Procedura di infiltrazione a 58°C

XILOLO-PARAFFINA (50%-50%) 2-3 ore

PARAFFINA pura (2-3 cambi) min. 2 ore

Inclusione

- Posizionamento del campione in contenitori sagomati

- Riempimento con paraffina liquida

- Solidificazione a Temp. ambiente

Sezionamento

Microtomo a rotazione CORPO

Gruppo porta-preparato

Porta-lama - Sagomatura del campione a forma di trapezio

- Montaggio sul gruppo porta-preparato

(fondendo paraffina e facendola risolidificare)

I campioni fissati per CONGELAMENTO rapido:

- NO disidratazione, NO inclusione in paraffina

- TAGLIO AL CRIOSTATO (0°C -45°C)

Sezionamento

- Campione montato sul braccio oscillante

- Manovella rotatoria che fa oscillare il braccio

µm)

- Regolazione distanza di avanzamento (1-50

Sezionamento

Ritmo costante di taglio: formazione di un nastrino di

sezioni

Con l’aiuto di un pennellino,

le sezioni vanno sistemate

in vaschetta con acqua

distillata riscaldata (40-45 °C)

Raccolta su vetrino

Asciugatura su piastra riscaldata

Colorazione

Le sezioni sono incolori e prive di contrasto

COLORANTI ISTOLOGICI: sostanze chimiche che si legano

a costituenti cellulari aumentandone il contrasto.

Alcuni coloranti vengono utilizzati direttamente su

cellule vive (e quindi non sottoposte a preparazione

istologica), per studiare direttamente al microscopio la

localizzazione di determinate strutture cellulari o

identificare particolari funzioni.

coloranti vitali.

Questi sono detti Sono incorporati

direttamente dalle cellule e si vanno a localizzare nelle

strutture verso cui sono preposti. Esempi:

(macrofagi, fagocitosi);

Trypan Bleu (mitocondri);

Verde Janus (fibre nervose).

Blu di Metilene

SCOPO DELLA COLORAZIONE

La colorazione è un procedimento che aumenta il

contrasto presente tra diverse strutture cellulari, tale da

permetterne il riconoscimento nelle sezioni istologiche.

Il termine “colorazione” è anche usato in modo improprio

anche in campo ultrastrutturale (per indicare i

procedimenti con cui si rendono elettron-opache le

M.E.) microscopia a

strutture al o nel campo della

fluorescenza (per indicare la procedura con cui le

molecole fluorescenti si legano alle strutture cellulari).

Cosa si intende per colorante

Per “colorante” si intende una molecola solubile e fornita di colore

proprio, capace di legarsi stabilmente a substrati cellulari e tessutali.

TUTTI I COLORANTI POSSONO ESSERE

SUDDIVISI PER LA LORO ORIGINE IN:

1) Naturali animali

(es: il carminio ricavato dalla cocciniglia)

2) Naturali vegetali

(es: l’ematossilina ricavata dal legno azzurro)

3) Artificiali

(denominati anche colori di anilina)


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AUTORE

Atreyu

PUBBLICATO

+1 anno fa


DESCRIZIONE DISPENSA

Materiale didattico per il corso di Istologia tenuto dal prof Simone Beninati. Al suo interno sono affrontati i seguenti argomenti:
[li]la microscopia ottica[/li]
[li]tecnica e procedure di preparazione di vetrini per l'osservazione microscopica[/li]
[li]fissazione e fissativi[/li]
[li]la procedura di lavaggio[/li]
[li]colorazione e struttura dei coloranti[/li]


DETTAGLI
Esame: ISTOLOGIA
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2011-2012

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Atreyu di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di ISTOLOGIA e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Tor Vergata - Uniroma2 o del prof Beninati Simone.

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