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Diagnosi DIRETTA

A. Esame microscopico (“a fresco”)

Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente

colorabili (o coltivabili) con le tecniche disponibili, evidenziabili

invece in campo oscuro:

– ricerca di Spirochete (Treponema, Borrelia)

– ricerca di Leptospire Osservazione in campo oscuro: Treponema pallidum

Diagnosi DIRETTA

A. Esame microscopico (previa colorazione)

• Campioni fissati (al calore o chimicamente)

• Fornisce indicazioni riguardo:

– idoneità del campione (nell’espettorato: numero di cellule squamose,

cellule colonnari ciliate, polimorfonucleati neutrofili, cellule mononucleate)

– presenza/assenza di microrganismi (batteri, funghi, parassiti)

• Colorazione del campione con tecnica di Gram:

– morfologia (cocchi, bastoncelli, cocco-bacilli, lanceolata)

– disposizione (catenelle, clusters, diplococchi)

– quantità assoluta di batteri presenti

– percentuale relativa di Gram+ e Gram-

– localizzazione intra/extra-cellulare del microrganismo

• Specifiche colorazioni:

– colorazione di Ziehl Nielsen (bacilli alcool-acido resistenti)

– verde malachite (endospore batteriche in Bacillus spp. e Clostridium spp.)

– colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina in Corynebacterium)

– colorazione di Leifson (flagelli)

Diagnosi DIRETTA

A. Esame microscopico previa colorazione

Colorazioni SEMPLICI: che prevedono l’impiego di un solo

colorante:

– cristalvioletto

– fucsina basica

– blu di metilene

Colorazioni DIFFERENZIALI: che prevedono l’impiego di

più di un colorante:

– colorazione di Gram

– colorazione di Ziehl-Neelsen

Le colorazioni in microbiologia

Allestimento di un preparato (fissazione) (1 di 2)

La fissazione garantisce che: i) il materiale venga

disteso ed essiccato non venga rimosso dal vetrino

nel corso dei successivi lavaggi; ii) le cellule vengano

uccise per coagulazione (sicurezza biologica e

maggiore penetrazione ai coloranti)

Partendo da una sospensione

batterica (brodocoltura) centro

di un vetrino pulito

Se si preleva il materiale

(colonie) da terreno agarizzato,

aggiungere una goccia di

soluzione tampone (PBS) al

campione

Le colorazioni in microbiologia

Allestimento di un preparato (fissazione) (2 di 2)

Aiutandosi con un’ansa,

stemperare il campione nel

tampone/brodo e stenderlo fino

a coprire circa la metà della

superficie del vetrino

(preparazione dello smear)

Lasciare essiccare il preparato

all’aria o forzatamente

(bunsen).

Fissare il preparato esponendo

il vetrino (lato non contenente il

campione) per 4-5 volte

direttamente alla fiamma

Hans Christian Joachim Gram

Nato a Copenhagen il

13 Settembre1853.

Batteriologo danese.

Inventò la colorazione

omonima nel tentativo di

Klebsiella

differenziare

pneumoniae dagli

pneumococchi

Colorazione di Gram

Tecnica Fissare gli strisci al calore

1. Coprire con cristalvioletto per

2. 1-2 min

Lavare con acqua. Non

3. asciugare

Coprire con la soluzione

4. iodio-iodurata di Lugol per 1-

2 min

Lavare con acqua. Non

5. asciugare

Decolorare per 10 sec con

6. alcool-acetone

Lavare con acqua. Non

7. asciugare

Coprire con safranina (2.5%

8. in alcool 95%) per 1-2 min

Lavare con acqua e lasciare

9. asciugare

Colorazione di Gram: colorazione regressiva e differenziale

Colorazione di Gram

Principio

Nei batteri Gram+ il cristalvioletto

e lo iodio si combinano a formare

un complesso (CV-I) di grosse

dimensioni che precipita

all’interno della cellula.

Il decolorante condensa, per

disidratazione, la struttura

peptidoglicanica. In questo modo,

il complesso CV-I viene

“catturato” dalla parete cellulare.

Nei batteri Gram- il decolorante

agisce come solvente lipidico,

dissolvendo la membrana esterna

della parete cellulare,

permettendo così il rilascio del

complesso CV-I e, quindi, la

decolorazione della cellula

batterica.

Colorazione di Gram

Osservazione microscopica

I batteri Gram+ (Staphylococcus

spp, Streptococcus spp, etc)

appaiono colorati in blu

(Staphylococcus epidermidis)

I batteri Gram- (E. coli, P.

aeruginosa, Neisseriaceae, etc.)

appaiono colorati in rosso

(Escherichia coli)

Colorazione di Gram

Casi particolari

Trichomonas vaginalis (protozoo)

è Gram+

Candida albicans (lievito),

Aspergillus fumigatus (muffa) sono

Gram+

Occasionalmente, anche

Mycobacterium tuberculosis è

Gram+ (oppure Gram-variabile)

Colorazione di Gram

Utilità clinica (1 di 2)

Idoneità del campione da sottoporre a coltura

Es. nell’espettorato: numero di cellule epiteliali ed infiammatorie

Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva)

meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni

piogene

Suggerire la necessità di attuare tecniche di coltivazione

“non routinarie”

ricerca di anaerobi, funghi

Ausilio nella interpretazione dell’esame colturale

angina di Vincent (spirochete - Borrelia vincentii, fusobatteri -

Fusobacterium fusiforme)

nel paziente antibiotizzato

Informazioni sulla natura dell’infezione

infezioni poli/mono-microbiche

Colorazione di Gram

Utilità clinica (2 di 2)

Quindi:

La conoscenza del risultato di una colorazione

di Gram può salvare una vita !

Tuttavia:

La colorazione di Gram non deve essere effettuata su

campioni clinici (feci, escreato) in cui la flora patogena

non può essere differenziata da quella commensale

La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di:

Legionella spp. (immunofluorescenza)

bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (Ziehl-

Neelsen)

Colorazione di Gram

L’eccezione

La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i

batteri.

Mycobacterium tuberculosis, M. leprae

incapacità di colorare la cellula per la natura

“cerosa” dell’involucro esterno, altamente

impermeabile ai coloranti

colorazione di Ziehl-Nielsen

Mycobacterium spp.

Parete cellulare

Composizione:

Grosse quantità di glicolipidi:

acido micolico (60%)

complessi lipidi-arabinogalattani

lipoarabinomannani

Scarso petidoglicano

Funzioni:

Condiziona la forma e previene la lisi osmotica

(peptidoglicano)

Inibisce ingresso composti chimici

crescita lenta

maggiore resistenza agli agenti chimici

maggiore resistenza alla fagocitosi

Mediante l’acido micolico, induce la sintesi di citochine

(TNF-α)

Colorazioni:

Ziehl-Neelsen, Kinyoun

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Tecnica (1 di 2)

Step 1:

versare la fucsina fenicata

(fucsina basica in acqua, alcool e

fenolo)

Step 2:

fare evaporare il colorante

alla fiamma per 5 min

lavare con acqua

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Tecnica (2 di 2)

Step 3:

Decolorare (2 min, circa) con

alcool-acido fino alla scomparsa

del colorante

Lavare con acqua

Step 4:

Contrastare con blu di metilene

per 1-2 min

Lavare con acqua

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Osservazione microscopica

Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono

colorati in rosso

Gli organismi non acido-resistenti risulteranno

colorati in blu

Le colorazioni in Microbiologia

Colorazioni speciali

La colorazione negativa consiste nella

colorazione di sottofondo con un colorante

acido (nero nigrosina). Viene usata quando

un organismo od una sua struttura non viene

colorata facilmente (esempio, la capsula).

La colorazione delle spore richiede calore

per facilitare la penetrazione del colorante

(verde di malachite, fucsina fenicata)

attraverso gli involucri sporali.

La colorazione dei flagelli impiega un

mordenzante (precipitazione dei sali

dell’acido tannico) per evidenziare la struttura

flagellare altrimenti invisibile (d: 12-30 nm)

Le colorazioni in Microbiologia

Colorazione di flagelli

Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori

(da: Di Bonaventura et al., J. Clin. Microbiol., 1997)

Diagnosi DIRETTA

A. Esame microscopico: significato diagnostico

Le informazioni desunte dall’esame microscopico possono

consentire una diagnosi presuntiva e, comunque, risultano

importanti per orientare l’iter diagnostico (es. scelta dei terreni

colturali per l’isolamento).

TUTTAVIA:

L’esame microscopico può fornire precise indicazioni diagnostiche

qualora si esamini:

materiale normalmente sterile o comunque proveniente

– un

da zone non comunicanti con l’esterno (liquido cefalo-

rachidiano, essudato pleurico o peritoneale, materiale

purulento proveniente da raccolte chiuse);

– un materiale nella cui popolazione batterica “normale” non

siano compresi batteri con i caratteri morfologici e/o

tintoriali del batterio osservato.

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

= volta a stabilire la presenza dell’agente

DIAGNOSI DIRETTA

patogeno mediante:

A. Esame microscopico (batterioscopico)

B. Esame colturale (isolamento)

C. Ricerca di antigeni

D. Ricerca di sequenze geniche

Daignosi DIRETTA

B. Esame colturale (isolamento)

Terreni di coltura. Si distinguono in base allo stato fisico:

• LIQUIDI (brodo)

• SOLIDI (brodo normale solidificato con agar)

TERRENI DICOLTURA LIQUIDI (BRODI)

• Utilizzati soprattutto nei casi di campioni per i quali si prevede

una bassa carica microbica (liquidi biologici, aspirati, etc.)

• Terreno liquido “classico“: BRODO NORMALE o BRODO

NUTRITIVO

– peptone (composto derivato dalla digestione parziale di

proteine animali) 0,5%

– estratto di carne 0,3%

– NaCl (per rendere isotonico il terreno)

– tampone fosfato (PBS; pH 7,0)

– H O

2

TERRENI DI COLTURA SOLIDI

(AGARIZZATI)

AGAR

• utilizzato per solidificare i terreni colturali liquidi

• polisaccaride acido estratto da alghe rosse del genere Gelidium,

frequenti nei mari tropicali

• formato per il 70% da agarosio e per il 30% da agaropectina

• viene utilizzato a concentrazioni pari a 1.5-2%

VANTAGGI:

• non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri

>

• liquido a temperature 80°C

• gelifica a temperatura compresa tra 42-47°C

• consente di solidificare il terreno, permettendo un esame

qualitativo (aspetti coloniali macroscopici) e quantitativo (stima

della carica batterica) dell’isolamento

COMPOSIZIONE CHIMICA DEI TERRENI

Chimicamente definita

molto costosi, utilizzati esclusivamente per l’identificazione di

batteri con particolari esigenze nutrizionali

Indefinita

contenenti sostanze naturali quali peptone, siero, liquido

ascitico, sangue, estratto di lievito etc.

TERRENI DI COLTURA

Terreni minimi

Utilizzati di rado, contengono carbonio, azoto, zolfo e

fosforo sotto forma di sali inorganici, aggiunti a

concentrazione nota

Terreni di arricchimento

Più frequentemente utilizzati (soprattutto per far crescere

dal

microrganismi patogeni particolarmente “esigenti”

punto di vista nutritivo), sono addizionati di:

• sangue

• siero

• estratto di lievito

• infusi di cuore e cervello

• carboidrati

• amminoacidi

TERRENI DI COLTURA

Terreni non selettivi

Consentono la crescita della maggior parte delle specie microbiche:

• Agar sangue (agar base + 5% sangue montone/cavallo)

• Agar cioccolato (agar base + emina, NAD e vitamine), per

l’isolamento di germi “esigenti” dal punto di vista nutritivo

(Haemophilus spp, Neisseria spp., Str. pneumoniae). Il

caratteristico color cioccolato deriva dal trattamento termico del

sangue che ne causa la emolisi e, quindi, il rilascio dei fattori di

crescita. Agar sangue Agar cioccolato

TERRENI DI COLTURA

Terreni selettivi

A differenza dei terreni non selettivi, questi terreni contengono agenti selettivi

quali:

• coloranti (cristalvioletto, verde brillante, fucsina basica)

• antibiotici, con attività batteriostatica/battericida nei confronti dei

microrganismi “contaminanti” (flora autoctona)

Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni che si isolano in

campioni prelevati da siti caratterizzati (“contaminati”) da una da

flora microbica residente (cute, faringe, naso, intestino, vagina).

Esempi:

• Thayer-Martin agar (vancomicina, colistina, trimethoprim lattato, selettivo per

Neisseria spp.)

• MacConkey agar (sali biliari, cristal violetto selettivi per Enterobacteriaceae)

• agar sale-mannite (7.5% NaCl selettivo per stafilococchi)

• agar SS (sodio citrato, sali biliari e verde brillante selettivi per Salmonella spp.,

Shigella spp.) TERRENI DI COLTURA

Terreni differenziali

Contengono ingredienti in grado di differenziare specie microbiche sulla

base di caratteristiche biochimiche:

• carboidrati (zuccheri) ed indicatori di pH (rosso fenolo, blu di

bromofenolo), che consentono di distinguere tra microrganismi in grado di

fermentare specifici carboidrati, in base alla colorazione delle colonie e

alla loro morfologia (agar sale –mannite, MacConkey agar)

• sangue (5% di montone oppure cavallo) per evidenziare la capacità di

emolisi dei batteri:

– α-emolisi = emolisi parziale che dà luogo alla formazione di un alone verde

intorno alla colonia per degradazione della bilirubina a biliverdina

β-emolisi

– = emolisi completa che dà luogo alla formazione di un alone

trasparente intorno alla colonia

γ-emolisi

– = mancanza di emolisi

Agar sale-mannite (Chapman agar):

terreno selettivo/ differenziale (S.

aureus fermentante vs Staphylococcus

spp non fermentanti) per stafilococchi.

γ-

α-, β-,

Agar sangue:

emolisi

Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica

R. Cevenini, V.Sambri

Piccin FATTORI CHE INFLUENZANO LA

CRESCITA BATTERICA

TEMPERATURA

• Psicrofili -10°C a +20°C ( L. monocytogenes, 5-8°C)

• Mesofili +10 a +50°C (la quasi totalità dei batteri patogeni)

• Termofili +40 a +70°C

FATTORI CHE INFLUENZANO LA

CRESCITA BATTERICA

Aerobi Aerobi Anaerobi Anaerobi Microaerofili

obbligati facoltativi obbligati facoltativi

OSSIGENO

Aerobi obbligati: crescono solo in presenza di ossigeno atmosferico

Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico

Anaerobi facoltativi: crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie

Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di

ossigeno; crescono bene in atmosfera addizionata di CO 2

CRESCITA IN ANAEROBIOSI

I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido,

depositandosi sul fondo come sedimento.

Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali.

Terreni riducenti: sono terreni che contengono dei composti chimici

(tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l’ossigeno

atmosferico fino ad esaurirlo.

Incubatori speciali: a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche

(bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono

umidificate, producono CO e H e successivamente H O con scomparsa

2 2 2

dell’ossigeno.

Crescita in anaerobiosi

Cappa (camera) per

anaerobiosi Giara per anaerobiosi Figure 6.5

FATTORI CHE INFLUENZANO LA

CRESCITA BATTERICA

pH

– Acidofili:

• crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente)

• funghi e lieviti (pH 5 - 6)

– Neutrofili:

• crescono tra pH 6 – 8

• maggior parte dei batteri

– Alcalofili:

• crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente)

FATTORI CHE INFLUENZANO LA

CRESCITA BATTERICA

PRESSIONE OSMOTICA

I microrganismi replicano generalmente meglio in un

terreno con concentrazione osmotica più bassa della

propria, in quanto questa condizione permette la

penetrazione dell’acqua all’interno della cellula.

La pressione osmotica del terreno può essere modificata in

base alla concentrazione di cloruro di sodio o di glucosio

Alofili: crescono ad elevate [saline]

(generalmente 1 M), tollerando elevate

pressioni osmotiche (es. stafilococchi)

CRESCITA BATTERICA

IN TERRENO LIQUIDO

Gran parte dei batteri patogeni ha un tempo di duplicazione

nell’ordine dei 40-60 min. In particolare:

• Escherichia coli (in vitro) 20-30 min

• Escherichia coli (in vivo) 12 ore

• Mycobacterium tuberculosis (in vitro) 18 ore

• Treponema pallidum (in vitro) 33 ore

ISOLAMENTO BATTERICO

E’ necessario tenere conto del sito di provenienza del campione:

• pus

• liquido cefalo rachidiano

• sangue

generalmente contengono un solo tipo di microrganismo

• materiale fecale

• tamponi oro-faringei

• altri materiali biologici

generalmente contengono microrganismi contaminanti, oltre al

patogeno o ai patogeni responsabili dell’infezione

ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE

TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN

SUPERFICIE

• Utilizzare terreni solidi (agarizzati) preparati in piastre di Petri

• Deporre una piccola quantità di materiale patologico da esaminare

al margine della piastra (se il materiale è molto denso stemperarlo

con soluzione fisiologica o brodo sterile)

• Mediante l’utilizzo di una spatola o di un’ansa, distribuire il

materiale sulla superficie del terreno in modo da avere la

formazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di semina e

colonie isolate nell’ultimo tratto

• Successivamente, prelevare sterilmente i batteri di una colonia

isolata (formata cioè da una sola cellula batterica iniziale) ed

allestire una coltura pura

Tecnica di semina per isolamento

Semina per isolamento

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

DIAGNOSI DIRETTA: IDENTIFICAZIONE

Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terreni

solidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate si

procede alla identificazione:

• ID PRESUNTIVA

– caratteri microscopici

» colorazioni (forma, organizzazione)

– caratteri macroscopici

» aspetto coloniale

• ID FINALE (DEFINITIVA)

– biochimica

– immunologica

– molecolare

ID “presuntiva” dei microrganismi

Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2)

Forma Rilievo

d < 1 mm

puntiforme effuso sottile, allungato

circolare piatto

irregolare, a filo

filamentosa sopraelevato

intrecciato

irregolare, ramificata

rizoide convesso

irregolare umbonato

ID “presuntiva” dei microrganismi

Aspetto macroscopico delle colonie (2 di 2)

Superficie Margine

intero

liscia ondulata

rilevata ondulato

radiata eroso

anelli concentrici

concentrica filamentoso

raggrinzita

rugosa arricciato

Aspetto macroscopico coloniale:

diversi fenotipi

DIAGNOSI DIRETTA

Identificazione dei microrganismi

1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)

Colorazione di Gram

Colorazione di Ziehl-Neelsen

2. Caratteristiche macroscopiche (colturali)

tipo (aspetto) coloniale

emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.

crescita su terreni selettivi

3. Caratteristiche biochimiche

4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)

5. Identificazione molecolare

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

La determinazione di “specie” si basa sulla capacità del

microrganismo in esame di:

– metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per via

fermentativa (via anaerobica)

– produrre specifici enzimi

– produrre specifici prodotti metabolici

Utilizzo di metodi “manuali” od “automatizzati”.

Identificazione possibile in tempi rapidi (sistemi automatizzati: 4 - 6 h)

oppure previa incubazione o/night (sistemi “manuali”, 16-20 h).

ID BIOCHIMICA

Metodo manuale: API (BioMérieux) Identification System

Anaerobes (Rapid ID 32 A)

Enterobacteriaceae (ID 32 E)

Gram Negative Rods (ID32 GN)

Staphylococci (ID32 STAPH )

Streptococci (Rapid ID32 STREP)

Yeasts (ID32 C) La fermentazione degli zuccheri e

l’utilizzazione di altri substrati (ureasi, indolo,

gelatina, etc.) viene evidenziata da un

indicatore di pH responsabile della reazione

colorimetrica.

ID BIOCHIMICA

Metodo automatizzato: VITEK (BioMérieux)

Due tipologie di card: per la identificazione (30 pozzetti/card contenenti dei substrati biochimici in

forma disidratata) e l’antibiogramma.

Non sono richiesti reagenti addizionali, riducendo così il rischio di omissione o di errore.

Il database del VITEK copre oltre 300 specie sia di origine clinica che industriale.

Possibilità di generare reports statistici epidemiologici (es. frequenza di antibiotico-resistenze)

Gram-positives (GP)

Gram-negatives (GN)

Yeasts (YST)

Bacillus spp. (BCL)

Anaerobes, Corynebacterium (ANC)

Neisseria, Haemophilus (NH)


PAGINE

110

PESO

3.46 MB

AUTORE

Atreyu

PUBBLICATO

+1 anno fa


DESCRIZIONE DISPENSA

Materiale didattico del corso di Medicina di Laboratorio tenuto dal prof. Giovanni di Bonaventura della sezione di MEDICINA DI LABORATORIO: MICROBIOLOGIA CLINICA riguardante i seguenti argomenti: la diagnosi batteriologica; diagnosi diretta ed esame al microscopio; le colorazioni in microbiologia; tecnica della colorazione di gram; tecnica della colorazione di Ziehl Neelsen; colorazione di flagelli; terreni di coltura solida e liquida; IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (ordinamento U.E. - 6 anni)
SSD:
A.A.: 2011-2012

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Atreyu di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di MEDICINA DI LABORATORIO e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Gabriele D'Annunzio - Unich o del prof Di Bonaventura Giovanni.

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