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acido Bicinconinico (BCA )

Saggio • Anal. Biochem.

P.K. Smith et al. (1985) 76.

150:

• Anal. Biochem.

K. J. Wiechelman et al. (1988) 231

175:

Saggio acido Bicinconinico (BCA)

• Molto sensibile e rapido se si usano alte

temperature

• Compatibile con molti detergenti

• Il reagente è stabile

• Piccole variazioni tra proteine diverse

• Ampio e lineare intervallo di lavoro

• La reazione non va a completamento se

condotta a temperatura ambiente

Saggio acido Bicinconinico (BCA)

1. Preparare la quantità necessaria di 1 volume di solfato di rame a 50

volumi di una soluzione di acido bicinconinico.

2. Prepare un set di provette contenenti il campione e albumina sierica

bovina nel range da 0 a 100 microgrammi. Ogni provetta deve

contenere un volume totale di 0.1 mL.

3. Aggiungere 2.0 mL del reagente in ogni provetta e agitare.

o

4. Incubare le provette a 60 C per 15 min.

5. Raffreddare le provette a temperatura ambiente e misurare

l’assorbanza a 562 nm.

Saggio (Bradford)

Dye-Binding

• CBBG risponde soprattutto alle arginine

(otto volte che gli altri residui)

• Per proteine ricche di arginina è opportuno usare

• Uno specifico standard

• CBBG si lega a questi residui nella forma anionica

Assorbimento a 595 nm (blue)

• Il colorante libero in soluzione è nella forma

• cationica (blu)

Assorbimento massimo a 470 nm (rosso).

• Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram

Analytical Biochemistry 72:

quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. 248-254. 1976.

• Methods in Enzymology 182:

Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. 50-69 (1990).

Saggio (Bradford)

Dye-Binding

• Veloce ed economico

• Altamente specifico per le proteine

• Molto sensibile [ µg

1-20 (micro saggio)

µg

20-200 (macro saggio)]

• Compatibile con diverse sostanze

• Il colorante complessato si forma in

circa 15 min ed è stabile per circa 1

ora

• Curva standard non-lineare su un

ampio intervallo di concentrazioni

• Risposta variabile per proteine

diverse, quindi la scelta di uno

standard è molto importante

Saggio BioRad

proteine

• Dopo 10 minuti, l’assorbanza può essere letta a 595 nm.

L’assorbanza è stabile per un’ora.

Saggio (Bradford)

Dye-Binding

• Gli spettri di assorbimento anionico e cationico del colorante si

sovrappongono.

• Questo determina una curva standard non lineare, in realtà è lineare

su piccoli intervalli di concentrazione.

• Se il campione contiene più di 20 microgrammi, viene fuori una

curva di secondo ordine che fitta meglio che la curva lineare.

Saggio (Bradford)

Dye-Binding

1. Accendere lo spettrofotometro 15 min. prima dell’uso

2. Diluire i campioni con tampone a una concentrazione di 1-20

microgrammi/ul

3. Preparare gli standards contenenti 1-20 microgrammi proteina

µl

(albumina o gamma globuline) in un volume di 1000

4. Preparare I campioni sconosciuti da misurare da 1 a 20

microgrammi di proteina per provetta .

5. Aggiungere 200 ul di reagente Bradford e complementare a 1000 ul

con acqua. Mescolare con forza e incubare 10 minuti a

temperatura ambiente .

6. Misurare l’assorbimento a 595.

Assorbimento ultravioletto 280 nm

• Può rappresentare un’ottima tecnica quando non si ha

alcuna idea della concentrazione di un campione che

deve essere assolutamente recuperato.

• Si usa in genere prima di passare a metodi più precisi e

sensibili

• La detrminazione si basa sull’assorbimento specifico

degli aminoacidi aromatici tirosina e triptofano

• La misura è soggetta a interferenza da altri componenti

cellulari e in particolare acidi nucleici

• Il metodo non è molto sensibile e presuppone l’uso di

cuvette di quarzo

• Il vantaggio reale è che il campione non viene distrutto e

la misura è molto rapida.

Ultraviolet Absorbance (pro e contro)

• Vantaggi

• Veloce

• Recupero campione

• Utile per fare screening di concentrazione

• Svantaggio

• Sensibile alla presenza contaminati come Sali e altre

molecole biologiche

• Essendo varia la composizione in aminoacidi elle

proteine è difficile la scelta di uno standard

• L’assorbanza è fortemente influenzata da pH e forza

ionica della soluzione.

Assorbimento Ultravioletto

Procedura

1. Azzerare lo spettrofotometro con acqua o tampone

2. Misurare l’assorbimento a 280 nm in cuvette di quarzo

3. Cambiare lunghezza d’onda a 260 nm, far lo zero con acqua o

tampone

4. Misurare l’assorbimento a 260 nm in cuvette di quarzo

5. Usare la seguente equazione per calcolare la concentrazione

proteica –

[Proteina] (mg/mL) = 1.55*A 0.76*A

280 260


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AUTORE

Atreyu

PUBBLICATO

+1 anno fa


DESCRIZIONE DISPENSA

Il corso si interessa di studiare i seguenti argomenti. E' tenuto dal prof Nicola Franceschini
Attività di laboratorio.
1. Deteminazione concentrazione proteica: metodo Bradford e misure di assobimento a 280 nm
2. Determinazione attività enzimatica: fosfatasi, determinazione Km e Vmax
3. Tecniche elettroforetiche: SDS-PAGE, western blot, zimografia (determinazione peso molecolare macromolecole)


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie
SSD:
Università: L'Aquila - Univaq
A.A.: 2011-2012

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Atreyu di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di TECNICHE DI LABORATORIO BIOMEDICO e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università L'Aquila - Univaq o del prof Franceschini Nicola.

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