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d. rivelatori: sono dispositivi sensibili al passaggio di un composto, anche a livello di

universali

tracce, che li attraversa, disciolto nel flusso di eluente. Si dividono in se sono

selettivi

sensibili a diversi tipi di composti (non a tutti) e se sono sensibili solo a particolari

sostanze. In realtà non è possibile in HPLC avere dei rivelatori veramente universali,

utilizzabili in ogni caso. Ce ne sono perciò di diverso tipo, basati su principi diversi. Le loro

sensibilità, intervallo di linearità, limite di

prestazioni si valutano in base ai parametri:

rivelabilità i cui significati sono gli stessi della GC.

I principali sistemi di rivelazione sono:

• rivelatori conduttometrici: sono rivelatori selettivi che non consentono eluizioni a

gradiente. Si basano sulla misura differenziale della conducibilità della sola fase mobile

rispetto a quella della fase mobile contenente ioni disciolti

• rivelatori rifrattometrici: sono universali ma non consentono eluizioni a gradiente. Si

basano sulla misura differenziale dell’indice di rifrazione dell’eluente puro e dell’eluente

contenente sostanze diverse in uscita dalla colonna

• rivelatori spettrofotometrici UV: sono tra i più usati in HPLC perchè molte molecole

organiche (cromofori) assorbono nell’UV. Altre sostanze possono essere trasformate in

cromofori facendole reagire con reagenti particolari. Essi possono operare a lunghezza

d’onda fissa (254 nm a cui molti composti organici assorbono) o a lunghezza d’onda

variabile. In questo caso c’è bisogno anche di un monocromatore; le misure sono

differenziali nel senso che c’è un confronto continuo tra l’intensità della radiazione che

attraversa l’eluente puro (che non deve assorbire) e quella che attraversa l’eluente

contenente un composto disciolto, in uscita dalla colonna

• rivelatore a fluorescenza: sono rivelatori selettivi che possono operare anche in

gradiente. Rivelano solo particolari sostanze capaci di emettere radiazioni di fluorescenza

quando vengono irradiate con radiazioni UV di particolare lunghezza d’onda

• rivelatori FT-IR: non consentono eluizioni a gradiente. Permettono la registrazione dello

spettro IR di una sostanza in “trasformata di Fourier”, mentre essa sta attraversando il

rivelatore

• rivelatori polarografici: sono rivelatori selettivi per sostanze elettroattive

• rivelatori FID: consentono eluizioni a gradiente. Sono utilizzabili con eluenti non

acquosi; l’eluente viene allontanato per evaporazione e i composti in esso contenuti

vengono ionizzati da una microfiamma, generando una corrente cui corrisponde un picco

nel cromatogramma

• rivelatori a ECD: consentono l’eluizione a gradiente; sono selettivi nei riguardi di

composti aventi elevate affinità elettroniche come gli alogenoderivati aromatici. Si

impiegano con eluenti non acquosi dotati di bassa affinità elettronica in modo che questi

non riescano a catturare elettroni, mentre le sostanze elettroaffini in essi contenute,

vengono meglio evidenziate 5

4.4.2 Materiali e tecniche analitiche

a. fasi stazionarie: possono essere diverse a seconda della tecnica adottata e quindi del

meccanismo di separazione utilizzato. Da un punto di vista generale si può dire che le

particelle sono di due tipi:

• pellicolari: sono formate da un nucleo solido centrale, in genere di vetro, che supporta

uno strato a piccolo spessore di materiale poroso

• microporose: sono microparticelle costituite direttamente da materiale poroso, senza

nucleo centrale. Possono essere di forma sferica o irregolare. Presentano, rispetto alle

pellicolari, diametri medi nettamente inferiori, maggiori capacità ed efficienza di

separazione.

A seconda poi delle diverse tecniche impiegate, le fasi stazionarie possono avere le seguenti

caratteristiche:

• cromatografia liquido-solido (LSC): il meccanismo di separazione è l’adsorbimento e

quindi le particelle di fase stazionaria (pellicolari o microporose) sono costituite da un

solido attivo. I materiali sono gli stessi usati nella TLC e nella cromatografia su colonna

classica: gel di silice, allumina, poliammide, cellulose modificate. La selettività in questo

caso è dovuta ai diversi valori che assumono i coefficienti di adsorbimento relativi alle

diverse sostanze che costituiscono le miscele da separare

• cromatografia liquido-liquido (LLC): in questo caso il meccanismo di separazione è la

ripartizione e quindi la fase stazionaria è costituita da un liquido non volatile che è

depositato sotto forma di uno strato sottilissimo, su particelle pellicolari o microporose di

gel di silice, allumina, kieselguhr. La selettività è data in questo caso dalle diverse

solubilità presentate dalle sostanze contenute in una miscela, nei riguardi dei due liquidi

che costituiscono la fase stazioneria e quella mobile; in sostanza dipende dai diversi

valori dei coefficienti di ripartizione. Il liquido che costituisce la fase stazionaria

dovrebbe essere del tutto immiscibile nella fase mobile. Questo non è sempre possibile

per cui il principale problema che presenta questa tecnica è quello relativo alla fase

stazionaria liquida che tende ad abbandonare la colonna; ciò comporta un esaurimento

della colonna che perde rapidamente efficienza.

Si è rimediato a questo inconveniente della LLC, creando delle fasi stazionarie legate

chimicamente al supporto solido in modo che non vengano trascinate via dalla fase

cromatografia a fasi legate chimicamente BPC

mobile. Si parla allora della (bonded

phase c.) che costituisce una nuova tecnica. In essa le microparticelle (pellicolari o di

vetro o di gel di silice), avendo sulla superficie gruppi polari -OH possono reagire con

che si legano chimicamente ai supporti solidi

alcoli (R-OH) o con triclorosilani R-Si Cl 3

R-OH O-R

OH Cl OH

| idrolisi |

O - Si - R O - Si - R

R-Sill 3 | |

Cl OH

6

I radicali R possono essere diversi (radicali alifatici da C a C o radicali aromatici o

1 18

) - NH )

amminoalchilici - (CH 2 n 2

• cromatografia di esclusione (EC): il meccanismo di separazione si basa sull’esclusione

totale o selettiva di molecole aventi pesi molecolari elevati, le cui dimensioni sono tali da

non permettere il loro passaggio all’interno delle particelle polimeriche a maglia

tridimensionale o da consentirne solo alcuni. Le fasi stazionarie sono costituite da

polimeri o copolimeri quali stirene, stirene-divinilbenzene, poliacrilammide, PVA, sotto

forma di gel semirigidi o rigidi per resistere alle alte pressioni esistenti nelle colonne.

b. fasi mobili: sono solventi organici ad elevato grado di purezza (specifici per HPLC) e

dotati di diversa polarità. Anche in questo caso, diversi Autori hanno suggerito elenchi di

eluotropiche).

solventi disposti in ordine di polarità crescente (serie

In genere i solventi più usati nelle diverse tecniche, in ordine di polarità crescente, sono:

n-esano, isoottano, cicloesano, CCl , toluene, benzene, etere dietilico, cloroformio, cloruro

4

di metilene, tetraidrofurano (THF), metiletilchetone (MEK), acetone, diossano, acetato di

etile, acetonitrile, piridina, dimetilformammide (DMF), propanalo, etanolo, metanolo, acqua.

Questi solventi possono essere usati allo stato puro o in miscela tra loro (uno apolare e uno

polare), a composizione costante per tutta la durata della cromatografia o a composizione

variabile per graduarne la polarità.

4.4.3 Parametri cromatografici e prestazioni in HPLC

Anche in HPLC, al termine di una separazione analitica, si registra un cromatogramma a

picchi che, data l’alta efficienza di queste tecniche, hanno un’ampiezza molto piccola.

Anche in questo caso, in perfetta analogia alla GC, i parametri del cromatogramma sono:

• tempo di ritenzione t : è il tempo necessario perchè una certa sostanza attraversi la

R

colonna e sia rivelata dal rivelatore. Dipende dal grado di affinità che la sostanza stessa

ha nei riguardi della fase stazionaria (espressa come si è detto dai coefficienti di

adsorbimento, ripartizione, di distribuzione in genere)

• :

tempo morto t è il tempo necessario perchè una sostanza che non dà nessuna

M

interazione con la fase stazionaria e quindi per niente trattenuta da essa, esca dalla

colonna

• volume di ritenzione V : è il volume di fase mobile necessario per il trasporto di una

R V = t Q

certa sostanza dall’ingresso all’uscita della colonna: dove Q è la portata

R R E E

dell’eluente in ml/min

• volume morto V : è il volume di eluente che attraversa la colonna nel tempo morto

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AUTORE

Atreyu

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie
SSD:
Università: L'Aquila - Univaq
A.A.: 2011-2012

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Atreyu di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di TECNICHE DI LABORATORIO BIOMEDICO e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università L'Aquila - Univaq o del prof Franceschini Nicola.

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