Che materia stai cercando?

Anteprima

ESTRATTO DOCUMENTO

Interazione soluto-fasi

Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi

(mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe

trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono

sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni:

• legami a idrogeno

• interazioni dipolo-dipolo

• interazioni dipolo-dipolo indotto

• forze di Van der Waals

• formazione di composti di interazione

• attrazione coulombiana

• interazioni steriche

In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità

delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello

stesso processo cromatografico

Meccanismi della separazione

In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo suddividere i meccanismi

di separazione impiegati in cromatografia in:

 adsorbimento

 ripartizione

 scambio ionico

 esclusione

 affinità Adsorbimento

La fase stazionaria è un solido in polvere steso su un supporto; sulla

superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono stabilire legami

deboli (reversibili!) con le molecole della miscela da separare. Si parla

quindi di cromatografia di adsorbimento, che può essere gas-solido o

liquido-solido a seconda della natura della fase mobile

La cromatografia di adsorbimento è

utilizzata per separare sostanze neutre

polari o non polari, di natura organica o

inorganica

Ripartizione

La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte o è

ad esso chimicamente legato; in questo liquido le molecole da separare sono

solubili; la fase stazionaria e la fase mobile devono invece essere

immiscibili.

Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi

secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi di cromatografia di

ripartizione, che può essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda della

natura della fase mobile

La cromatografia di ripartizione è chiamata

in fase normale se la fase stazionaria è più

polare della fase mobile, mentre è chiamata

fase inversa se la fase stazionaria è meno

polare della fase mobile. Si tratta della

tecnica più comunemente impiegata per la

separazione di sostanze organiche

Scambio ionico

La fase stazionaria è costituita da un polimero inerte contenente siti attivi

ionizzati o ionizzabili, i cui controioni possono essere scambiati con altri

ioni aventi carica dello stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato

sulla competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile

e quelli presenti nel campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico

(IEC)

La cromatografia a

scambio ionico è

impiegata per la

separazione di sostanze

ioniche o ionizzabili

Esclusione dimensionale

La fase stazionaria è un solido poroso o un gel.

Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le

loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le

molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in

tempi brevi

Si parla di cromatografia di

esclusione dimensionale (SEC)

o

Gel permeazione per la

separazione di sostanze insolubili in

acqua

o

Gel filtrazione per la separazione

di sostanze solubili in acqua

La tecnica è impiegata per la

separazione di molecole di grandi

dimensioni

Affinità

In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto

specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase

stazionaria e si ottenga così l’eluizione selettiva di alcuni componenti della

miscela. Si parla di cromatografia di affinità (AFC)

La cromatografia di affinità è

impiegata nella separazione di

molecole di interesse

prevalentemente biochimico

Stato fisico della fase mobile

In base allo stato fisico della mobile possiamo classificare le tecniche

cromatografiche come segue:

Cromatografia Liquida (LC): la fase mobile è un liquido nel quale siano

solubili i componenti della miscela da separare; la fase stazionaria deve

essere insolubile nella fase mobile

Gascromatografia (GC): la fase mobile è un gas che funge da carrier per i

componenti della miscela

Cromatografia fluida supercritica (SFC): la fase mobile è un fluido

supercritico, con proprietà intermedie tra un liquido e un gas

Forma del letto cromatografico

In base alla forma del letto cromatografico su cui è realizzato il processo

separativo, possiamo le seguenti varianti:

• Cromatografia su colonna: la fase stazionaria è contenuta all’interno di

una colonna cilindrica, che può riempire completamente (colonna

impaccata) oppure rivestirne la superficie interna (colonna tubulare)

• Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una superficie

piana, che può essere un supporto cartaceo (cromatografia su carta, PC) o

una lastrina in vetro o altri materiali (cromatografia su strato sottile, TLC)

Tecniche cromatografiche

In base alla forma del letto cromatografico

Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular)

Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)

 In base allo stato fisico della fase mobile

Cromatografia Liquida (LC)

Gascromatografia (GC)

Cromatografia fluida supercritica (SFC)

 In base al meccanismo di separazione

Adsorbimento

Ripartizione

Scambio ionico

Esclusione

Affinità

Cromatografia liquida

La cromatografia liquida è impiegata per la separazione di sostanze non

volatili, neutre o ioniche, e di sostanze termolabili. Si presta facilmente a

misure quantitative. Si possono separare sostanze appartenenti a varie classi

tra cui, di interesse archeometrico:

• aminoacidi, peptidi e proteine

• idrocarburi

• carboidrati

• terpenoidi

• ioni inorganici

Cromatografia planare

Si tratta di un gruppo di tecniche di cromatografia liquida di semplicissima

applicazione, spesso impiegate per avere informazioni preliminari. La fase

stazionaria è supportata su lastre di vetro, fogli di alluminio o di plastica nella

versione TLC (Thin Layer Chromatography) e su fogli di carta da filtro nella

versione PC (Paper Chromatography)

Le fasi stazionarie più usate sono il gel di silice e l’allumina per la cromatografia

di adsorbimento, la cellulosa per la ripartizione liquido-liquido (in questo caso la

fase stazionaria è l’acqua adsorbita sulle particelle di cellulosa)

Cromatografia planare

L’esecuzione dell’analisi è molto semplice: la miscela da separare va

depositata sulla superficie, posandone con un tubo capillare una goccia su

una linea che segna l’inizio del processo di eluizione

Quindi il foglio o la lastrina si pongono in una vaschetta contenente la fase mobile che

per gravità (modalità discendente), per capillarità (modalità ascendente) o per

diffusione laterale (modalità orizzontale) fluisce sulla fase fissa trascinando gli analiti e

separandoli

Cromatografia planare

(a) camera di sviluppo a flusso ascendente

(b) camera di sviluppo a flusso orizzontale

Cromatografia planare

Il risultato è (spesso ma non sempre) visualizzabile sotto forma di macchie

colorate, ognuna dovuta ad un componente della miscela. Il riconoscimento delle

sostanze può avvenire effettuando separazioni su miscele standard; in questo caso il

parametro che caratterizza i soluti separati è il cosiddetto Rf o fattore di ritardo.

Per ogni analita il valore di Rf si ottiene misurando la distanza percorsa dal centro

della macchia e confrontandola con la distanza percorsa dal fronte dell’eluente:

Rf = d / d

analita eluente

Il valore di Rf degli analiti è quindi sempre compreso tra 0 e 1.

I valori ottimali sono compresi tra 0.4 e 0.8

Visualizzazione dei risultati

Nel caso le macchie non siano colorate, è possibile ricorrere a due metodi

per visualizzare il risultato della separazione:

• utilizzare una lampada UV per irraggiare la lastrina, se le sostanze separate

non assorbono la luce visibile ma assorbono nell’ultravioletto (λ < 400

nm); può essere necessario addizionare alla fase stazionaria o alla fase

mobile un indicatore di fluorescenza che permette di localizzare le macchie

• spruzzare la lastrina con una soluzione contenente sostanze in grado di

reagire con i costituenti della miscela separata, generando composti

colorati; può essere necessario scaldare leggermente la lastrina per favorire

la reazione

Irraggiamento con UV

Separazione di coloranti

antrachinonici con TLC e

illuminazione con lampada

UV a 254 nm (dx);

l’intensità delle macchie può

essere valutata con un

colorimetro (sotto) O

O

Addizione di reagenti cromogeni

Nell’immagine sotto è mostrato un contenitore per

l’aspersione di ninidrina su lastrine TLC o PC

Alcuni esempi di reagenti correntemente impiegati per

evidenziare le macchie sono riportati nella tabella

sottostante Reagente Utilizzo

Iodio in EtOH per composti azotati

AgNO in NH per sostanze riducenti

3 3

Alizarina per cationi

Ninidrina per amminoacidi e ammine

HS per cationi e metalli pesanti

2


PAGINE

41

PESO

4.97 MB

AUTORE

Atreyu

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Esame: BIOCHIMICA
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie
SSD:
Università: L'Aquila - Univaq
A.A.: 2010-2011

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Atreyu di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di BIOCHIMICA e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università L'Aquila - Univaq o del prof Pitari Giusi.

Acquista con carta o conto PayPal

Scarica il file tutte le volte che vuoi

Paga con un conto PayPal per usufruire della garanzia Soddisfatto o rimborsato

Recensioni
Ti è piaciuto questo appunto? Valutalo!

Altri appunti di Biochimica

Amminoacidi - Degradazione e ciclo dell'urea
Dispensa
Acidi grassi - Ossidazione
Dispensa
Acidi grassi - Biosintesi
Dispensa
Enzimi
Dispensa