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In condizioni appropriata si può avere un precipitato antigene-anticorpo che può

essere utilissimo in campo analitico anche perché avviene in maniera massimale

per rapporti definiti di anticorpo e di antigene (punto di equivalenza).

Si hanno molti metodi di immunoprecipitazione che vengono usati in laboratorio. tra

di essi: diffusione monodimensionale;

diffusione doppia bidimensionale;

immunodiffusione radiale semplice;

immunoprecipitazione in mezzo liquido.

Tecniche radio immunologiche

Queste tecniche hanno permesso avanzamenti notevolissimi specialmente nel

dosaggio degli ormoni. ma sfortunatamente esse implicano costi piuttosto elevati e

l'uso di materiali radioattivi che sono instabili nel tempo ed il cui smaltimento è

costoso.

Concettualmente le tecniche radiommunologiche sono molto semplici. E’

necessario avere un analita marcato (reperibile in commercio) e un anticorpo che ad

esso specificamente si leghi. Quando si incuba l'analita con il suo anticorpo si

ottiene un legame e quindi un aumento della radioattività legata all'antigene ed una

diminuzione della radioattività libera. Nel campione biologico esiste una certa

quantità dell'analita (ovviamente non radioattivo) e quando il campione viene

incubato insieme all'antigene e all'analita marcato si ha una competizione per

l'antigene tra l'analita marcato (aggiunto) e quello non marcato (presente nel

campione). Maggiore la quantità di analita non marcato. minore la radioattività nella

fase legata (complesso antigene-anticorpo), mentre maggiore quella della fase

libera (antigene non legato all'anticorpo). Pertanto la radioattività della fase legata

diminuisce quando la concentrazione dell'analita nel campione da dosare aumenta.

I pregi di questa tecnica consistono nell'elevata specificità e sensibilità. E’ evidente

che per usare questo metodo è necessario ottenere una perfetta separazione tra

antigene libero ed antigene legato. Sono state proposte varie metodiche. tra cui

l'adsorbimento dell'antigene libero su supporti vari. come la cellulosa e resine varie.

oppure la precipitazione mediante doppio anticorpo o ancora l'utilizzazione

dell'anticorpo in fase solida (l'anticorpo viene legato ad una resina e la soluzione

contenente l'antigene fatta scorrere attraverso la resina stessa).

Tecniche enzimoimmunologiche

In alternativa agli antigeni marcati con radionuclidi. si possono usare antigeni

marcati con enzimi (EIA-Enzyme Immuno Assay).

Per utilizzare le tecniche enzimoimmunologiche innanzitutto è necessario preparare

l’enzima unito alle proteine o agli apteni. Gli enzlmi più utilizzati come marcatori

sono la perossidasi. la fosfatasi alcalina, la glucosio ossidasi, l'acetilcolinesterasi,

la malato deidrogenasi ed altri.

Sostanzialmente la tecnica prevede:

• il legame di un enzima con un aptene;

• il legame dell'enzima-aptene con l'anticorpo in presenza dell'aptene da dosare

(maggiore quest'ultimo. minore l'anticorpo che si lega al complesso enzima-

aptene);

• l'individuazione della quantità del complesso aptene-enzlma-anticorpo mediante

variazione dell'attività enzimatica o previa separazione della frazione libera e

legata.

Lo stesso discorso può essere fatto legando l'enzima all'anticorpo. anziché

all'aptene.

L'enzimoimmunologia in fase omogenea comprende quelle metodiche per cui

l’enzima nel complesso marcato (antigene o anticorpo) si comporta in maniera

diversa dall'enzima libero. In questo caso non esiste la necessità di separare la

frazione libera e frazione legata, la cui separazione invece è necessaria se le due

frazioni non possono essere altrimenti distinguibili.

La enzimoimmunologia in fase eterogenea può essere effettuata con varie tecniche,

tra le quali la E.L.I.S.A. (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) che prevede il

legame dell’anticorpo ad una matrice insolubile, come cellulosa, biogel, sephadex,

ecc.

E.L.I.S.A. sandwich - La sostanza da dosare si lega all’anticorpo già legato alla

resina. Viene quindi usato un secondo anticorpo a cui è unito l’enzima. Se il primo

anticorpo è legato con l’aptene, anche il secondo vi si lega. Questo può essere

svelato dosando l’attività enzimatica.

E.L.I.S.A. competitivo – Differisce dal R.I.A. per il solo fatto che viene usato un

enzima (al posto del radionuclide) per marcare l’antigene che compete con quello

presente nel materiale biologico in esame.

La ricerca di nuove tecnologie che utilizzino il legame antigene anticorpo è molto

attiva perché queste presentano l'indubbio vantaggio di essere molto sensibili e

specifiche e quindi permettono dosaggi di sostanze in quantità piccolissime, prima

non rilevabili.

Il confronto si pone tra EIA e RIA. La sensibilità delle due tecniche è notevole, anche

se spesso è superiore quella ottenibile con i metodi RIA. Le analisi RIA sono però

più inquinanti (materiale radioattivo) e richiedono attrezzature più costose, sia in

fase di investimento che d'uso.

Nefelometria e turbidimetria

La nefelometria e la turbidimetria sono le due tecniche che rilevano la formazione

degli immunocomplessi in mezzo liquido.

La nefelometria, o INA (Immuno NephelometricAnalysis), misura l’intensità delle

radiazioni rifratte da una sospensione di immunocomplessi;

(si noti che la nefelometria non è una tecnica spettrofotometrica.)

Sospensioni molto diluite possono essere analizzate mediante turbidimetria, o TIA

(Turbidometric Immuno Analysis), cioè misurando l’attenuazione della potenza di un


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AUTORE

Atreyu

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+1 anno fa


DESCRIZIONE DISPENSA

Materiale didattico per il corso di MEDICINA DI LABORATORIO dell'Università degli studi di Perugia riguardante i seguenti argomenti: le principali metodologie utilizzate in biochimica clinica; l'elettroforesi; la spettrofotometria; la fluorimetria; i traccianti radioattivi; le tecniche radio immunologiche; le tecniche enzimoimmunologiche; nefelometria e turbidimetria.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (ordinamento U.E. - 6 anni) (PERUGIA, TERNI)
SSD:
Università: Perugia - Unipg
A.A.: 2011-2012

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Atreyu di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di MEDICINA DI LABORATORIO e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Perugia - Unipg o del prof Tassi Carmelo.

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