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Microbiologia con fondamenti di immunologia

Scrittura discorsiva al pc, presi a lezione, sufficienti per il superamento dell'esame. Gli argomenti trattati riguardano le tipologie di batteri (Gram positivo e Gram negativo), la parete batterica, virologia, riproduzione fagica, infezione, vaccini, immunologia e retrovirus.

Esame di Microbiologia, immunologia e virologia docente Prof. G. Conti

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Funzioni delle porine:

Canali che permettono il passaggio di sostanze idrofiliche attraverso la membrana esterna; hanno

diversi ruoli:

• Ruolo nella resistenza ai farmaci:

sostituzione di aminoacidi neutri con aminoacidi carichi che si proiettano all’interno del poro e

perturbano la normale diffusione degli antibiotici in presenza di antibiotici viene diminuita od

eliminata l’espressione delle porine implicate nella diffusione di quell’antibiotico

• Funzione di recettori:

per fagi, per batteriocine, per componenti del complemento, per anticorpi

• Fattori di patogenicità batterica:

possono promuovere l’invasione delle cellule dell’ospite. l’aderenza l’attività citotossica. (vengono

secrete in piccole vescicole che si fondono con la membrana delle cellule eucariotiche)

Esempi di porine di E. coli:

• OmpF, OmpC: diffusione di ioni ed altre piccole molecole

• PhoE: indotta da “phosphate starvation”

• LamB: indotta da maltosio ed altre maltodestrine nel mezzo

• FhuA: uptake del Ferro

Esiste poi una SOLO NEI GRAM - una componente lipopolisaccaridica (LPS), che non corrisponde

ad un doppio strato fosfolipidico, che viene inserita sulla parete più esterna della membrana

esterna. La membrana citoplasmatica, presente in entrambi i tipi di batteri, è a doppio strato

fosfolipidico più interno rispetto al peptidoglicano.

LPS è anche detta endotossina batterica, ed è composta di tre porzioni:

1. Antigene O (esterno): è connesso strettamente al core e contiene galattosio, glucosio,

ramnosio e mannosio. Polimero di unità oligosaccaridiche (in media 40 unità), è un

trisaccaride lineare pluriramificato caratterizzato da almeno 20 diversi tipi di zucchero.

Rappresenta la parte più variabile alla base della classificazione sierologica dei batteri

Gram-

2. Antigene R (centrale): definito “core polisaccaridico”; esempio classico è quello della

Salmonella in cui il core è costituito da chetodeossioctonato (KDO), zuccheri eptosi (7

atomi di carbonio), glucosio, galattosio e NAG.

3. Lipide A (interno): la composizione chimica varia a seconda della specie; è la porzione che

può essere tossica per gli animali e costituisce il complesso dell’endotossina. Generalmente

è un glicofosfolipide, consiste in un dimero di NAG-fosforilata con legati acidi grassi a

catena lunga. Rappresenta la porzione idrofobica che si ancora alla membrana esterna.

O e R sono chiamati antigeni perché caratterizzati da caratteristiche antigeniche ovvero sono

responsabili di una risposta difensiva da parte del sistema immunitario dell’ospite infetto.

L’LPS è una barriera di permeabilità selettiva (ancor più selettiva della membrana interna) che si

oppone al passaggio di molecole idrofobiche (dovuto alla catena laterale O, idrofilica, del LPS) e di

molecole idrofiliche (dovuto al doppio strato fosfolipidico) al di sopra di certe dimensioni. L’LPS

rappresenta una importante struttura di superficie nell'interazione dell'agente patogeno con il suo

ospite (per es. può essere coinvolto nell'adesione (colonizzazione) e nella resistenza alla

fagocitosi); è sede dei determinanti antigenici; se liberato in un ospite sensibile, dà luogo a

numerosi effetti tossici, è l’endotossina batterica.

L’LPS liberato dai batteri si lega alla LBP (LPS binding Protein) che si trova in circolo; a sua volta LBP

si lega al CD14 sui macrofagi. 7

Le esotossine sono diverse da LPS (il cui lipide A rappresenta le endotossine) perché definiscono la

patogenicità di un batterio.

La membrana esterna tipica dei Gram- è quindi composta da:

• Fosfolipidi: simili a quelli della membrana citoplasmatica, situati nel foglietto interno.

• Lipopolisaccaride: costituisce con la sua componente lipidica la maggior parte del foglietto

esterno.

• Proteine: inserite a varie altezze.

• Lipoporoteina: ancora la membrana esterna allo strato sottostante di peptidoglicano.

Il microscopio ottico, anche il più semplice, permette di vedere batteri e micoplasmi.

Tutti i batteri sono definiti simbionti (parassitismo, commensalismo).

I batteri possono essere divisi in due scale: una di patogenicità, ovvero quelli che danno o meno

infezione, e una di virulenza, ovvero in base al grado di aggressività. Possono avere armi

biologiche come ad esempio le tossine.

Il componente LPS ha due funzioni:

1. Caratteristiche antigeniche: un meccanismo di difesa;

2. E’ sede della componente di tossicità.

Esistono le ENDOTOSSINE, tipiche dei Gram-, e le ESOTOSSINE, presenti in entrambi.

POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE (residente) DEL CORPO UMANO

Il corpo umano è sterile alla nascita e va incontro a colonizzazione al momento del parto; esistono

quindi due distretti:

• Distretti sterili: vie sanguigne e linfatiche, organi interni, sistema nervoso

• Distretti colonizzabili: tutte le parti comunicanti con l’esterno, cute e mucose – cavità

orale, prime vie respiratorie, apparato gastro-enterico, uro-genitale (colonizzato nell’uretra

a meno che la popolazione non ecceda), congiuntiva dell’occhio, canale uditivo esterno.

Rapporti microrganismo-ospite

La maggior parte dei microrganismi sono utili nell’ambiente poiché coinvolti in importanti cicli

della materia, trasformazioni geochimiche e processi biologici. Possono produrre sostanze utili

(antibiotici, farmaci, proteine) e quindi sono molto sfruttati soprattutto nelle industrie alimentari e

farmaceutiche. Possono instaurare diversi tipi di rapporti con organismi superiori quali

mutualismo, rapporto vantaggioso per entrambi; commensalismo, il contraente trae beneficio

mentre l’altro è indifferente; parassitismo, un contraente trae beneficio mentre l’altro riceve un

danno. I microrganismi patogeni sono in grado di provocare malattia infatti instaurano un

rapporto di parassitismo più o meno obbligatorio.

Funzioni importanti delle flora microbica interna:

• Produzione di vitamine: K e alcune del gruppo B

• Stimolazione e maturazione del sistema immunitario: il sistema immunitario è detto

adattativo o specifico poiché si adatta per difendersi da ogni infezione a carico di

microrganismi. E’ in grado di distinguere dal non-self e per fare questo deve maturare,

ovvero deve attivare a carico della flora batterica residente.

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• Competizione con organismi patogeni: che vengono a contatto con l’individuo. Il patogeno

per cominciare l’infezione ha bisogno di posizionarsi in un distretto, e la flora batterica ha il

compito di contrastare la sua sedimentazione (dismicrobismo).

Il feto alla nascita è sterile, successivamente incomincia il processo di colonizzazione, più si cresce

più avanza anche lo stadio di colonizzazione interna come ad esempio accade nell’ultimo tratto

dell’intestino tenue e nell’intestino crasso.

Si definisce colonizzazione il processo che viene compiuto da microrganismi “buoni” che

accompagnano l’individuo fino alla fine della vita nell’ospite.

Si definisce contaminazione quel processo che avviene da parte di microrganismi che causano

infezione sia interne che esterne e dunque patogeni.

Le infezioni possono essere:

• esogene: avvengono dall’esterno da un individuo ad un altro. I microrganismi non volano

né galleggiano, ma hanno bisogno di un tramite. Questo primo individuo infetto lo

trasmette all’esterno, la trasmissione è esterna ed è determinata da veri organismi

patogeni.

• endogene: sono causate dagli stessi microrganismi che fanno parte della normale flora

microbica dei distretti colonizzati detta anche residente. Questa è formata da organismi

che competono dunque il numero non deve e non aumenta in modo eccessivo altrimenti la

popolazione in sovrannumero riuscirebbe a creare un’infezione.

Nell’ospite c’è un organismo di difesa passiva come ad esempio il fluido lacrimale (ricco di

lisozima), il muco, i movimenti peristaltici dall’intestino o anche la cute. I microrganismi che sono

commensali possono dare infezione, cosa che normalmente non fanno grazie alle difese

dell’ospite o per la competizione con altri microrganismi.

Modalità di acquisizione delle malattie da infezione esogena:

• Ingestione di cibo o bevande contaminate; questa categoria si divide in:

o Tossinfezione: nel cibo è presente il microrganismo che produce la tossina

o Intossicazione: nel cibo c’è solo la tossina mentre il microrganismo è morto

Un microrganismo può provocare uno stato morboso anche senza vita parassitaria attraverso la

produzione di sostanze tossiche che contaminano gli alimenti causando tossico infezioni alimentari

come Staphylococcus aureus (nelle cavità nasali, aerobio, dissenteria per 24h), Clostridium

botulinum (anaerobio, paralisi flaccida botulinica) e Bacillus cereus (aerobio).

• Via aerea: il batterio o virus si trova nel distretto respiratorio ed utilizza il nebulizzato

(starnuto) come modalità attiva per infettare un altro organismo.

• Inoculazione diretta: attraverso punture di insetti(zanzare o zecche), morsi di animali

(pipistrelli trasmettono rabbia o ebola[?]) o trasfusione.

• Penetrazione traumatica: attraverso ferite.

• Via sessuale: Neisseria gonorrheae (gonorrea), Treponema pallidum (sifilide) che può

portare all’aborto, Chlamidia trrachimatis (Clamidia).

• Trasmissione verticale: avviene tra la madre ed il feto attraverso la palcenta (Treponema

pallidum) oppure tra la madre malata e il neonato attraverso il latte materno (Listeria

monocytogenes).

• Esistono degli arbovirus, ovvero ARthropod-BOrn virus, virus trasmessi dagli artropodi.

• La trasmissione dei virus tra adulti sono dette orizzontali.( O meglio, per trasmissione

orizzontale si intende la trasmissione tra individui della stessa specie solitamente, e senza

relazione madre-figlio; es via sessuale vedi HIV – virus dell’immunodeficienza umana).

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Esempi:

MALATTIA AGENTE EZIOLOGICO VETTORE SERBATOIO

Peste Rickettsia rickettsii Pulce Ratto

Febbre Q Coxiella brunetii Zecca Zecche, bovini

Tularemia Franscisella tularensis Zecca Mammiferi

Febbre ricorrente Borrelia ricurrentis Pidocchio Uomo

Febbre delle trincee Bartonella quintana Pidocchio Pidocchi, uomo

I microrganismi patogeni sono in grado di contrastare o eludere le difese dell’organismo attraverso

mimetismo antigenico, fattori antifagocitari (strutture cellulari o sostanze secrete che impediscono

l’attacco dei fagociti) o grazie alle loro capacità di sopravvivere e/o moltiplicarsi all’interno delle

cellule fagocitarie. I virus hanno bisogno di un antirecettore virale per l’assorbimento di sostanze

nutritive e per l’adesione mentre per i batteri è necessario un antirecettore batterico per

l’attecchimento; si parla quindi di adesione per i virus, attecchimento per i batteri.

• Mimetismo antigenico: elaborano o hanno naturalmente dei sistemi anti-riconoscimento

ovvero antigeni che il nostro sistema immunitario scambia per self; sono strutture

proteiche o polisaccaridiche;

• Fattori antifagocitari: strutture cellulari o sostanze secrete che impediscono/alterano

l’attacco da parte dei fagociti;

• Sopravvivenza: capacità di sopravvivere e/o moltiplicarsi all’interno delle cellule

fagocitarie. I macrofagi sono un esempio di fagociti che, quando rilevano un non-self, lo

fagocitano e lo distruggono grazie all’azione di enzimi litici (lisosoma); alcuni microrganismi

non solo resistono a questi enzimi, ma sono in grado di replicare all’interno del macrofago.

Antigene: sostanza riconosciuta non-self che stimola una risposta di difesa e per essere indotta

l’antigene deve avere una massa notevole.

Gli apteni sono antigeni che danno le allergie, ma sono così piccoli e hanno un peso molecolare

così basso che il nostro sistema immunitario non riesce a respingerli; sono definiti immunogeni, e

per dare la risposta immunitaria devono essere legati a proteine carrier).

Fattori di patogenicità: ADESINE

Sono strutture di adesione dei microrganismi e si distinguono in:

• Fimbrie o Pili: appendici filamentose di natura proteica presenti sulla superficie di batteri

che consentono di aderire in modo specifico alle superfici. Le estroflessioni possono essere

di due tipi in base alle loro funzioni:

o Sessuali per il trasferimento di materiale genetico (sex pilus)

o Strutturali o funzionali: aderiscono ai recettori sulla cellula del distretto in cui

vogliono iniziare un’infezione;

• Capsula o glicocalice: strato mucoso superficiale di vario spessore costituito da

polisaccaridi (raramente da polipeptidi) situato sulla superficie della cellula batterica.

È evidenziabile con inchiostro di china (colorazione negativa) o con reazioni immunologiche

(reazioni di rigonfiamento capsulare). Può essere responsabile di un’adesione specifica o

non specifica. Le strutture proteiche si trovano solo nei G+ e sono piuttosto rare anche in

questo caso, sono spesso polisaccaridiche.

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Il glicocalice ha uno strato più ridotto rispetto alla capsula che quindi ha più spazio per

nascondere degli antigeni che ne aumentino la virulenza. La sintesi della capsula è regolata

da fattori fenotipici (fattori ambientali, composizione del terreno o la fase di crescita) o da

fattori genetici. Nel genoma, infatti, esistono dei geni che determinano e regolano la sintesi

della capsula; questa può essere persa per mutazione (S-R). Un ceppo acapsulato può

diventare capsulato attraverso la trasformazione batterica sperimentata da Griffith. La

capsula può essere usata come materiale di riserva in condizioni estreme, protegge il

batterio dalla disidratazione ed è un importante fattore di virulenza.

• Acidi teicoici e lipoteicoici: sono componenti della parete dei GRAM + che possono

provocare adesione specifica o non specifica.

• Lipopolisaccaridi: componente LPS tipico dei GRAM – ai quali può essere attribuito il ruolo

di adesine, funzione svolta principalmente dall’ANTIGENE O, caratteristico in ogni virus (?)

• Proteina M: componente superficiale della parete di Streptococcus pyogenes

(faringotonsilliti, malattia reumatica). La proteina M è presente nella parete della specie

più patogena (pyogenes): βemolitico di gruppo A (ci sono 18 gruppi diversi) la cui

antigenicità è data dal polisaccaride C dello streptococco.

La capsula come fattore di virulenza batterica:

Ha proprietà antifagocitarie, proprietà adesive e permette alle cellule batteriche di dare origine a

micro colonie. I microrganismi capsulati sono dotati di maggiore virulenza rispetto a quelli

acapsulati; risultano, infatti, maggiormente invasivi grazie ala loro capacità di eludere i meccanismi

di difesa aspecifici dell’ospite, prima di tutto la fagocitosi. La prima tappa nella fagocitosi è il

riconoscimento della cellula batterica da parte del fagocita, questo avviene per interazioni fisico-

chimiche (idrofobia, presenza di cariche elettriche) o mediato da recettori (per il frammento Fc); in

assenza di anticorpi la capsula interferisce con entrambi i processi. La capsula rappresenta quindi

una superficie idrofilia che si oppone all’interazione con il fagocita; impedisce, con meccanismi

specifici e aspecifici,la fissazione dei fattori opsonizzanti.

• Fagocitosi di superficie: la fagocitosi, anche in assenza di anticorpi, si verifica su una

superficie rugosa o su un coagulo di fibrina il che permette l’adesione del fagocita al

batterio anche se questo è provvisto di capsula. Tale tipo di fagocitosi avviene ad esempio

nell’alveolo polmonare.

• Fagocitosi in presenza di anticorpi (Ac): si ha opsonizzazione mediata dal frammento Fc

oppure si ha opsonizzazione per attivazione della via classica del complemento.

Queste strutture superficiali, spesso codificate da geni plasmi dici, consentono l’interazione con

superfici cellulari dell’ospite(tropismo, specificità dell’apparato e ‘ospite). Spesso l’adesione è un

prerequisito per la successiva infezione-malattia. Virus e batteri hanno specificità riguardo al

substrato, al distretto a cui si agganciano; nei batteri è meno specifica.

Si ha quindi l’esposizione a patogeni, l’adesione a cute o mucose, l’invasione attraverso l’epitelio,

la colonizzazione e la crescita con conseguente produzione di fattori di virulenza. A questo punto

si può avere lo stadio di tossicità, gli effetti delle tossine sono locali o sistematici, o di invasività, si

ha ulteriore crescita sia nel sito originale d’infezione sia in siti distanti. In entrambi i casi si ha il

danno al tessuto e la malattia.

La patogenicità di un microrganismo si esplicita attraverso:

• Adesività legame specifico tra alcune strutture superficiali del microrganismo e

determinati siti recettoriali delle cellule dell’ospite.

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• Produzione di enzimi extracellulari: enzimi in grado di favorire la penetrazione dei

microrganismi attraverso la demolizione dei tessuti parassitati. L’aggressione avviene a

carico di enzimi come ad esempio lipasi, ialuronidasi, catalasi, coagulasi o altre proteasi.

• Inibizione della fagocitosi: strutture cellulari o sostanze microbiche secrete che

impediscono l’attacco dei fagociti.

• Produzione di sostanze tossiche: veleni microbici, generalmente di natura proteica, che

causano danni tissutali, a volte mortali, nell’Uomo e negli animali.

Patogenicità: capacità di un microrganismo di provocare malattia attraverso la sua invasività

(capacità di moltiplicarsi nell’ospite) e/o tossigenicità (capacità di produrre sostanze tossiche che

possono agire anche a distanza dal punto di infezione). La patogenicità è legata a caratteristiche

sia del microrganismo sia dell’ospite sensibile. I fattori di tossicità o tossigenicità dipendono dal

lipide A. Viene definito “pirogeno” un organismo in grado di provocare un innalzamento della

temperatura corporea.

Virulenza: grado di patogenicità (ceppi più o meno virulenti), legati a fattori che possono essere

presenti o meno in un microrganismo patogeno

Fasi dell’integrazione microrganismo-ospide:

In primis avviene il contatto tra microrganismo e ospite mediato da vettori inanimati o viventi; poi

serve l’introduzione del parassita nel microrganismo. La localizzazione: può essere casuale, dove

un organismo si stabilizza in un posto a caso, o elettiva, che comprende il tropismo di tessuto o di

organo, ovvero il microrganismo tende a sedimentarsi in un distretto ben preciso. Segue la

colonizzazione ovvero la moltiplicazione del microrganismo in un distretto senza che avvenga

alcun tipo di danno. Successivamente incomincia l’infezione dove la moltiplicazione del

microrganismo avviene con stimolazione del sistema immunitario; non è necessariamente

accompagnata da malattia. Si ha malattia quando il microrganismo infettante supera le difese

dell’ospite ed inizia a danneggiarlo, avviene la comparsa dei sintomi caratteristici della malattia. La

guarigione avviene con l’eliminazione del patogeno e la remissione dei sintomi. Per periodo

d’incubazione della malattia si intende quel periodo di tempo che intercorre tra il contatto tra

microrganismo e ospite e comparsa dei sintomi.

Attività tossiche dei microrganismi

I batteri hanno le tossine; i virus svolgono la loro tossicità con altri metodi.

Le esotossine batteriche sono proteine; alcune di esse sono sotto il controllo fagico, altre hanno

un controllo plasmidico e altre ancora cromosomico (nella stragrande maggioranza dei casi). Il

batterio della difterite (Gram+), estremamente pericoloso, produce un esotossina che deriva dal

genoma di due batteriofagi temperati integrati. Le tossine batteriche sono molecole con attività

tossica nei confronti dell’ospite; la produzione di tossine è uno dei meccanismi principali con cui i

batteri causano le malattie (es: tetano, difterite, pertosse, colera). Si dividono in endotossine

(componenti strutturali quasi sempre rilasciate in seguito a lisi) e in esotossine (rilasciate nel

mezzo esterno da cellule vitali).

Secondo il meccanismo di azione si possono distinguere tre tipi di tossine:

– superantigeni (tossine tipo I)

– esotossine che danneggiano le membrane della cellula ospite

(tossine tipo II)

– tossine A-B ed altre tossine che interferiscono con le funzioni

della cellula ospite (tossine tipo III) 12

Caratteristiche Esotossine Endotossine

Origine Batteri Gram+ e Gram- Batteri Gram-

Localizzazione Sintesi nel citoplasma e rilascio Componenti della struttura

anche dopo lisi batterica, non cellulare, in particolare la

solo per secrezione membrana esterna

Natura chimica Proteine (PM 50-1000 kDA) LPS (PM 10 kDa)

Stabilità Termolabili a 60-100 (per 30 Termostabili

min)

Antigenicità Presente Presente come LPS, lipide A

Formano anatossine Sì, ma non tutte No

Tossicità Elevata Relativamente bassa

Specificità d’azione Elevata, effetto specifico per Bassa, effetto comune per

ciascuna tossina tutte le endotossine

Attività enzimatica Presente Assente

Pirogenicità Occasionale Presente: azione pirogena

molto elevata

ENDOTOSSINE:

Le endotossine sono esclusive dei batteri Gram-, sono rappresentate dal lipopolisaccaride (Lipide

A: porzione tossica) della membrana esterna. Termostabili, sono scarsamente immunogene, si

liberano per lisi della cellula batterica ed hanno effetto pirogeno (inducono la febbre). Stimolano

la produzione di TNF e di IL-1, che in elevate concentrazioni causano aumento della permeabilità

vascolare, vasodilatazione, ipertensione e shock emodinamico (shock tossico).

Piccole dosi di endotossina:

Bersagli Attività Effetti

Monociti Sintesi di IL-1 e TNF Febbre

Macrofagi

Neutrofili Rilascio ammine vasoattive Vasodilatazione

Linfociti B Attivazione Produzione di anticorpi

Complemento Attivazione Infiammazione

Alte dosi di endotossina, invece, si ha coagulazione intravascolare (trombosi), shock e alterazione

della funzionalità di molti organi. L’endotossina di solito è un immunostimolante, talvolta può

anche essere una tossina.

Le endotossine hanno quindi diversi effetti:

• Effetto pirogeno: inducono febbre anche se in basse quantità

• Attivazioni di tipi cellulari: quali macrofagi, linfociti B, cellule endoteliali, piastrine e

granulociti

• Inducono infiammazione

• Inducono vasodilatazione con conseguente ipotensione e shock

• Attivazione del complemento

• Stimolazione della coagulazione del sangue: CID (coagulazione intravasale disseminata), si

hanno coaguli a livello del microcircolo causando ischemia con conseguente insufficienza

d’organi o consumo dei fattori della coagulazione e conseguenti emorragie.

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Lo shock endotossico è un grave quadro clinico che può accompagnare le setticemie (sepsi,

putrefazione a conseguente invasione dei tessuti da parte di patogeni) da batteri Gram-

caratterizzato da febbre, ipotensione, acidosi, insufficienza renale e respiratoria e, nelle fasi finali,

da insufficienza d’organo. Con una frequenza dell’ 1% dei pazienti ospedalizzati sviluppa sepsi e il

40-60% di questi ha un esito fatale nonostante terapie antibiotiche.

ESOTOSSINE:

Le esotossine sono tipiche dei batteri Gram+,ma vengono prodotte anche da alcuni batteri Gram-;

sono di natura proteica, termolabili e con forte potere immunogeno. Possono avere struttura

monomerica o dimerica. Queste ultime sono distinte in due peptidi (A e B) legati da ponti

disolfurici, dove A è il peptide con attività tossica, generalmente enzimatica, e B è quello che si

lega a specifici recettori della cellula bersaglio.

La loro produzione può essere sotto:

• Controllo plasmidico (es. plasmidi ENT in ceppi enteropatogeni di Coli, tossina

epidermolitica di Staphylococcus aureus)

• Controllo cromosomico (es. tossina colerica)

• Controllo fagico: conversione lisogena (tossina difterica, tossina eritrogenica di

Streptococcus pyogenes)

Classificazione delle esotossine in base al tipo cellulare su cui agiscono:

Tipo Proprietà Esempi

Citolitiche (emolisine, Ledono le membrane di Emolisine staffilococciche

leucocidine) specifiche cellule bersaglio

determinandone la morte

Enterotossine Attive sulle cellule della Tossina colerica

mucosa intestinale. In genere Enterotossine staffilococciche

causano diarrea Enterotossine di Coli

Neurotrope Attive sulle cellule del sistema Tossina tetanica

nervoso centrale o periferico Tossina botulinica

Pantrope Capaci di determinare il loro Tossina difterica

effetto tossico su vari tipi

cellulari dotati dei recettori

idonei

I legami delle esotossine con recettori di natura proteica presenti sulla superficie della membrana

cellulare inducono la cellula dell’ospite a generare un segnale trans membrana. Questo ha azione

diretta sulla membrana cellulare provocando la formazione di canali o la distruzione del doppio

strato lipidico. La traslocazione nel citosol di un componente enzimatico che agisce su una

molecola bersaglio a livello endocellulare apportando una modificazione post trascrizionale.

Il risultato della lisi osmotica è particolarmente grave quando riguarda cellule macrofagi che

(neutrofili, macrofagi); la loro morte per lisi osmotica causa il rilascio di tutte le armi che queste

cellule hanno elaborato con lo scopo di uccidere e degradare batteri creando gran danni ai tessuti

circostanti. Ascessi, pus etc. sono caratteristici di batteri come Stafilococchi e Streptococchi che

producono tossine che formano pori sulle membrane delle cellule.

Ci sono delle esotossine batteriche che, dal punto di vista immunologico, vengono riconosciute da

anticorpi (immunoglobuline) e neutralizzate. Le esotossine sono dei potentissimi antigeni, perché

sono proteine (i polisaccaridi sono anch'essi antigeni, ma meno potenti) (i lipidi non sono

antigeni). L'esotossina, quando viene neutralizzata, non è più in grado di legarsi ai recettori della

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cellula bersaglio. Nel caso delle esotossine monocatenarie (citolitiche) l'anticorpo riconosce tutto il

complesso proteico e lo neutralizza completamente.

P.s. Attività ADP-ribosilante: aggiunta di una o più molecole di ADP-ribosio ad una proteina. L’ADP-

ribosio proviene da una molecola di NAD+ che viene tagliata rilasciando nicotinammide.

Le anatossine sono esotossine che hanno perso la propria tossicità, ma hanno mantenuto la

caratteristica di antigene; di conseguenza, tali sostanze sono in grado di stimolare la produzione di

anticorpi senza arrecare danno all'organismo (alcuni vaccini).

Le esotossine citolitiche provocano la lisi dell'ospite, attraverso la disorganizzazione delle

membrane cellulari per solubilizzazione delle componenti lipidiche e proteiche. Possono essere

emolisine, fosfolipasi, epidermolitiche a seconda del tipo di cellula che vanno a lisare; sono

generalmente monomeriche o monocatenarie, al contrario della maggior parte delle esotossine

che sono dimeriche (la tossina è composta da due parti legate tra di loro).

Quando un batterio produce la sua esotossina dimerica, una volta secreta, B riconosce i recettori

cellulari; in questo modo il dimero è internalizzato e il componente B si stacca da A, che esplica la

sua azione tossica come enzima. Le esotossine citolitiche funzionano dall'esterno della cellula e

per questo sono monomeriche costituite solo dal componente B.

Esotossine inibenti la sintesi proteica: esistono esotossine che inibiscono la sintesi proteica della

cellula ospite, mediante ADP-ribosilazione, per esempio di EF2 (fattore di elungazione che agisce a

livello della traduzione); fra queste vi è l'esotossina difterica. Su EF2 agisce il componente A, che

blocca la sintesi proteica: A fosforila EF2; questo causa l’inibizione della sintesi proteica e quindi la

morte cellulare. Altre molecole ADP-ribosilanti possono essere l’enterotossina colerica e

l’enterotossina termolabile di Coli che agiscono sulla proteina G, stimolatrice dell’adenilato ciclasi,

che viene attivata; questo porta all’aumento di cAMP intracellulare quindi perdita d’acqua con

conseguente diarrea. La tossina della pertosse, invece, inattiva la proteina G inibendo così

l’adenilato ciclasi; si ha il conseguente aumento di cAMP che provoca alterazioni nella risposta

cellulare. Anche le tossine di C. botulinum e di C. perfringens causano ADP-ribosilazione, ma

agiscono sulle proteine del citoscheletro (actina) causando alterazioni nelle sue funzioni.

Esiste un'altra modalità di blocco della sintesi: A svolge un'attività catalitica (idrolizza) N-

glicosidasica sull'RNA ribosomiale 28s, per esempio la tossina di Shiga (agente eziologico della

dissenteria). Azione catalitica di Shiga: azotoglicosidasica, ossia idrolisi dell'RNA ribosiomale 28s,

che non essendo più presente, blocca la traduzione. Queste esotossine sono solitamente

dimeriche, si legano irreversibilmente alla cellula mediante interazione tra un recettore specifico

della cellula e il frammento B della tossina, mentre il frammento A costituisce la frazione tossica.

Pantrope: Esotossine che agiscono tramite blocco della sintesi proteica. Tossina difterica, tossina

di Shiga, tossina pertussica. La maggior parte di esse agisce secondo un'attività ADP-ribosilante.

Esiste un mediatore chimico, il NAD, che è il bersaglio di molte esotossine batteriche. Staccano la

nicotinamide e rimane l'ADP-ribosio, che viene legato dall'esotossina con legame covalente.

L'esotossina trasporta la molecola ad un bersaglio, il fattore di allungamento EF-2 che viene così

inattivato.

Enterotossiche: Tossine che agiscono all'interno di una cellula, che esplicano la loro azione a

livello della mucosa intestinale, causando diarrea e vomito. La gravità è strettamente dipendente

dal tipo di enterotossina coinvolta e dal tipo di meccanismo d’azione per l’infezione.

Neurotrope: Agiscono sempre interferendo con gli impulsi nervosi, a livello del sistema nervoso

centrale e periferico. Il modello è dato dalle tossine tetanica e botulinica: la prima agisce

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bloccando il rilascio dei neurotrasmettitori (esempio GABA) nel sistema nervoso centrale; la

seconda blocca il rilascio di acetilcolina nelle sinapsi periferiche. L'infezione a livello di SNC causa

una paralisi spastica, mentre a livello del SNP una paralisi flaccida.

Alteranti il contenuto intracellulare di cAMP:

Esistono esotossine che sono in grado di alterare il contenuto intracellulare di AMP-ciclico,

secondo messaggero chimico e mediatore estremamente importante. Ciò avviene con due

modalità differenti: in un caso, certe esotossine sfruttano un meccanismo ADP-ribosilante (tossina

colerica e pertossica) per alterare l'attività dell'enzima che trasforma l'ATP in AMP-ciclico; in un

altro, altre esotossine agiscono direttamente come enzimi con attività adenilato ciclasica

intrinseca (antracis) che sintetizzano autonomamente cAMP.

Esistono tre tipi di interazioni da parte delle esotossine:

• tossine che agiscono all'esterno della cellula eucariotica: citolitiche;

• tossine che si legano a recettori, agendo quindi sulla superficie esterna: sono generalmente

esotossine dimeriche (A e B);

• tossine che vengono iniettate dal batterio direttamente dentro alla cellula eucaiotica,

attraverso vari sistemi di secrezione: anch'esse possono essere dimeriche.

Le esotossine sono tossine che agiscono sulla superficie della cellula eucariotica, si legano a

recettori superficiali e agiscono su bersagli intracellulari. Queste tossine vengono iniettate dal

batterio all’interno della cellula eucariotica e agiscono su bersagli intracellulari.

1. Tossine che agiscono sulla superficie cellulare: (a livello della membrana plasmatica). Si

dividono in 3 classi:

a. Tossine formanti pori (emolisine e leucotossine) come l’alfa tossina dello

Streptococcus aureus

b. Tossine che causano danno alle membrane attraverso un’attività enzimatica come

ad esempio l’alfa tossina di Clostridium perfringens che causa la degradazione delle

piastrine quindi emorragie

c. Tossine con effetto detergente sul doppio strato lipidico

Agiscono tutte alterando la fisiologia e/o la struttura della membrana, determinando la lisi della

cellula.

2. Tossine batteriche con bersagli intracellulari; queste tossine batteriche sono prodotte sia

da Gram- che da Gram+ e raggiungono il loro bersaglio in due modi:

a. Per iniezione diretta dal citosol del batterio al citosol della cellula ospite attraverso

un sistema di secrezione di tipo III o IV

b. Dopo rilascio dal batterio si legano ad una o più cellule bersaglio mediante un

recettore specifico e sono internalizzate mediante endocitosi mediata da recettori.

Nota che un anticorpo neutralizza la tossina all'esterno della cellula, dato che non ha alcun mezzo

per entrare. Le esotossine sono veleni molto potenti, bastano piccole concentrazioni per causare

anche gravi danni. Nelle endotossine il discorso è diverso perché la loro azione è in funzione della

dose, e generalmente, la loro tossicità è minore.

Struttura delle esotossine.

Il termine struttura nei virus è sinonimo di simmetria, cosa che però non è applicabile alle

esotossine. Queste esotossine sono tutte quante formate da un dimero A e B che a loro volta

possono essere formati da più subunità. Ogni componente svolge il proprio ruolo, ma la tossicità è

appannaggio di entrambi. Le esotossine citolitiche sono definite monocatenarie, ossia formate da

un unico componente, di solito A. 16

A + B: tossine monomeriche, ossia sintetizzate dal batterio come un unico peptide, che poi

eventualmente viene tagliato per protolisi nei due componenti. B riconosce il recettore e A svolge

l'azione enzimatica. Nel caso della tossina difterica il peptide rimane tale e quale, e le due zone

della catena amminoacidica svolgono le due funzioni indipendentemente. Nella tossina tetanica e

botulinica invece il peptide è idrolizzato a formare un dimero a diverso peso molecolare (i due

componenti sono legati tramite un ponte disolfuro).

A + 5B: sono tossine multimeriche, sempre dimeriche perché formate da due componenti A e B

(formato da 5 subunità). I legami non sono covalenti. Sono tipiche di E. coli.

Vengono anche definite a struttura binaria: multifattoriale. È fatta da diversi componenti che

svolgono funzioni diverse. ES. tossina carbonchiosa.

Il gene che codifica per la tossina è portato da un fago lisogenico β che rende il batterio

tossigenico; è espressa in presenza di basse concentrazioni di ferro (repressore genico dipendente

da Fe). Viene prodotta come pre-protossina inattiva di 535 aa nel citoplasma del batterio; la pro

tossina è tagliata in due frammenti A e B rispettivamente di 21 e 37 kDa.

Tossina Microrganismo Collocazione Subunità Effetti biologici

del gene

Carbonchio Bacillus Plasmide 3 proteine -EF+PA: aumento di cAMP

anthracis (EF, LF, PA) -LF+PA:morte della cellula

bersaglio

Botulinica Clostridium Fago A-B Diminuzione di acetilcolina

botulinum nelle sinapsi periferiche:

paralisi flaccida

Colera Vibrio Cromosomico 2A-5B Attivazione di adenilato ciclasi:

cholerae diarrea

Difterite Clostridium Fago A-B Inibizione sintesi proteica

diphtherioe (morte cellulare)

Pertosse Boredetella Cromosomico A-5B Blocco della trasduzione del

pertussis segnale

Shiga Shigella Cromosomico A-5B Inibizione sintesi proteica:

dysenterioe morte cellulare

Tetano Clostridium Plasmide A-B Diminuzione del rilascio di

tetani neurotrasmettitori: paralisi

spastica

Non tutti i ceppi di E. coli sono benigni. Questa specie ha delle esotossine che si differenziano in

termolabili e termostabili. Il ceppo enteropatogeno ha un meccanismo di infezione simile a quello

del colera.

Batteri Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli sono aerobi. Quelli del genere Chlostridium

sono anaerobi obbligati. Le esotossine con attività ADP-ribosilante hanno sempre un meccanismo

che prevede il trasporto ad un bersaglio cellulare (che è diverso a seconda della specie e del

modello).

Tossina carbonchiosa (antrace): (Gram+)

Prodotta dal Bacillus anthracis. È un'esotossina multifattoriale, che è costituita da 3 componenti:

• PA: antigene protettivo che ha funzione immunogenica (componente B)

• EF: componente edematoso (edema: accumulo di liquidi in spazi interstiziali); è

un'adenilato ciclasi che potenzia la sintesi di cAMP (enzima batterico, in questo caso)

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• LF: componente letale. LF è una proteasi che inibisce un particolare metabolita dei

macrofagi, l'MAPKK, una chinasi proteica macrofagica che controlla la mitosi (ha quindi

un'azione mitogena sul macrofago). Inoltre ha un effetto citolitico sul fagocita.

Per poter funzionare, occorre che, in un primo momento, si uniscano PA ed LF e successivamente

PA ed EF. Funzionano quindi in maniera binaria, quando PA è legato ad LF svolge un determinato

ruolo, quando invece è legato ad EF ne svolge un altro.

Il batterio quando infetta produce inizialmente il componente PA83 (83 si riferisce al peso

molecolare in kDa), l'antigene protettivo. PA si lega a recettori sensibili, (svolge un ruolo simile, in

questo caso, a quello di B nelle esotossine neurotrope), in particolare a uno dei due recettori che

sono presenti sulla cellula (AntraxR1 e AntraxR2, con un corecettore). Esiste una proteasi che

agisce a livello di superficie cellulare nel distretto infettato: questo enzima rimuove da PA una

catena di peso molecolare 20kDa, dall'estremità N-terminale. In seguito a questo processo PA

diventa 63kDa. A questo punto PA forma un complesso eptamerico a forma di anello: il taglio della

proteasi ha esposto un sito specifico molto recettivo, che lega gli altri due componenti EF ed LF,

prodotti nel frattempo dal microrganismo. Si forma così un complesso binario, che si rivesti di

clatrina e viene introitato per endocitosi nella cellula eucariotica. Il pH acido causa idrolisi acida,

che libera i due componenti EF ed LF che svolgono l'azione enzimatica. Nota che se questi ultimi

non fossero stati legati a PA non sarebbero stati internalizzati. EF ha un'azione adenilato ciclasica,

cioè svolge direttamente l'azione enzimatica, che aumenta la concentrazione di AMP-ciclico

intracellulare, che sballa il sistema di regolazione della cellula. LF invece agisce su delle chinasi e le

inibisce, bloccando la fosforilazione nella cellula bersaglio, che in questo caso è il macrofago. La

cellula bersaglio muore di conseguenza.

In Bacillus antracis la tossina carbonchiosa è un’esotossina multifattoriale. Definita binaria per i

due fattori A, che hanno ruolo enzimatico, sempre in collaborazione con il componente B. Il nome

deriva dal fatto che quando un tessuto è infettato diventa nero. Si tratta di un aerobio obbligato,

che produce spore molto volatili.

I fattori responsabili della virulenza sono:

• Capsula: inibisce la fagocitosi delle cellule in replicazione

• Tossina edematosa: è formata dall’associazione dell’antigene protettivo, responsabile del

legame alla cellula ospite e del fattore edematoso (componente tumorale solitamente

benigna riferita a tessuto ghiandolare). La sua attività adenilato ciclasica è responsabile

dell’accumulo di fluido che si accumula nei casi di antrace

• Tossina letale: formata dall’antigene protettivo e dal fattore letale presente in una zinco-

metalloproteasi; la sua attività metalloproteasica stimola i macrofagi a rilasciare citochine

pro infiammatorie.

L'antrace è una malattia molto grave, con diversi meccanismi di infezione. La patologia che attacca

le vie respiratorie è una delle forme maggiormente rappresentate, ossia la più diffusa e la più

grave. La forma respiratoria ha un effetto totalmente deleterio: quando l'individuo assume per

inalazione le spore, di dimensioni piuttosto piccole, esse vanno ad attecchire anche a livello

alveolare. Negli alveoli c'è un'alta concentrazione di ossigeno, così la spora da origine alla forma

vegetativa che libera la propria esotossina. (meccanismo di azione delle esotossine multifattoriali).

I batteri di cui abbiamo parlato fin qui sono batteri che producono endospore, con un particolare

processo di formazione. Le spore hanno diverse forme, che rispecchiano la tipologia di attacco al

substrato.

Il carbonchio è una malattia degli erbivori; l’uomo si infetta per contagio con animali infetti o per

contatto con prodotti animali contaminati. Ci sono tre vie di infezione: inoculazione, inalazione o

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ingestione; circa il 95% delle infezioni risulta dall’inoculazione di spore attraverso la cute. L’antrace

contratto per via respiratoria è anche detto malattia dei “cordatori di lana” ed è causato

dall’inalazione di spore durante la lavorazione delle pellicce di capra.

Altri esempi: Esotossina tetanica e botulinica (Gram+) A+B

Sono neurotossine prodotte dal genere Chlostridium, batteri anaerobi obbligati.

Tetano: si interpone tra due neuroni, bloccando l'azione del neurotrasmetittore. Tra due neuroni

si ha che uno è eccitatorio, mentre l'altro è inibitorio (GABA e glicina): essi lavorano in

collaborazione in modo da garantire il corretto funzionamento muscolare dell'organismo. La

tossina tetanica altera il meccanismo eccitazione/inibizione, bloccando il rilascio del GABA e della

Glicina, determinando una contrazione continua e una paralisi spastica dei muscoli volontari.

C tetani produce due tossine: la tetanolisina, emolisina ossigeno labile il cui significato è ancora

sconosciuto, e la tetanospasmina, neurotossina termolabile A-B sintetizzata inizialmente come

unico peptide da 150 kDa e poi scisso in due per essere attivato. La porzione carbossiterminale

della catena pesante si lega ad un recettore di superficie presente sulle membrane dei neuroni. La

catena leggera della tossina, una proteasi specifica chiamata zinco-endopeptidasi, viene quindi

internalizzata e si muove dalle terminazioni periferiche verso il SNC mediante trasporto retrogrado

assonico. Viene quindi rilasciata dai dendriti post sinaptici, attraversa le giunzioni sinaptiche e si

localizza nelle vescicole delle terminazioni nervose pre-sinaptiche. La tetanospasmina agisce

bloccando il rilascio di neurotrasmettitori (es. GABA, glicina) nelle sinapsi inibitorie provocando

una de regolazione delle sinapsi eccitatorie (paralisi spastica). Il legame della tossina è irreversibile

per cui la guarigione dipende dal tempo necessario per la formazione di nuove terminazioni

assoniche.

Botulino:L'esotossina botulinica si pone a livello sinaptico e blocca il rilascio di acetilcolina a livello

periferico: l'acetilcolina causa a livello periferico la contrazione del muscolo, e se questo segnale

viene a mancare, perviene una paralisi flaccida.

La esotossina è prodotta inizialmente come un peptide unico che successivamente viene tagliato

da enzimi proteolitici, attivando così la tossina.

I due segmenti si dispongono parallelamente e vengono legati l'un l'altro da ponti disolfuro. La

forma attiva della tossina viene creata in seguito ad un taglio proteolitico, che determina la

comparsa di una catena pesante (circa 100 kDa) e una catena leggera (circa 50kDa). La catena

pesante lega in maniera specifica la superficie delle cellule bersaglio e permette l'internalizzazione

della catena leggera che determina l'azione enzimatica ovvero esprime la tossigenicità(dimero AB).

Entrambe le esotossine hanno un target comune ossia i trasportatori proteici dei

neurotrasmettitori (es. la sinaptobrevina, VAMP), che vengono idrolizzati bloccando di

conseguenza il rilascio del GABA e dell'acetilcolina.

Le vescicole con il neurotrasmettitore (glicina) hanno proteine di superficie (VAMP) necessarie per

il legame con la proteine (sinaptobrevina) presenti sulla porzione attiva del bottone sinaptico. La

neurotossina (che è un endopeptidasi) agisce mediante scissione delle VAMP in siti specifici,

impedendo il legame alle proteine del bottone e quindi anche la loro liberazione.

La tossina, una volta nell’organismo, non è inattivata dall’acidità gastrica o enzimi di stomaco e

duodeno. Nel lume dell’intestino si lega alla superficie apicale delle cellule epiteliali (tran sport

cell) e, mediante un processo di endocitosi e transcitosi, è trasportata e rilasciata dalla superficie

basolaterale delle cellule stesse. Questo permette alla tossina di raggiungere la circolazione

generale e le cellule target ovvero i neuroni pre-sinaptici nelle giunzioni neuromuscolari.

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Le esotossine di queste due patologie sono trasmesse in maniere totalmente diversa. Nel caso del

botulismo si ha a che fare con infezioni alimentari, generalmente si tratta di alimenti contaminati

inscatolati o conservati male. In questi casi, non si parla di tossinfezione (nel cui caso dovrebbe

essere presente anche il batterio), ma di intossicazione, ossia dalla presenza delle sole esotossine.

Le infezioni tetaniche non sono mai infezioni alimentati, sono determinate da traumi meccanici,

ossia ferite dalle quali penetra la spora. La spora poi esce dalla quiescenza e produce il batterio: il

batterio prolifera, ma permane solo nel sito di infezione. La sua tossina, invece, è rilasciata in

circolo e agisce nel SNC. (Il Chlostrydium tetani è presente nell'intestino dei bovini come flora

microbica normale). Si tratta in entrambi i casi di anaerobi, sporigeni.

Botulismo. Intossicazione acuta. L'infezione alimentare (la più diffusa) è efficacie, perché si tratta

di una esotossina che agisce a livello periferico: dall'intestino la tossina riesce a passare nel

torrente circolatorio, grazie a recettori specifici che interagiscono con le membrane della parete

intestinale; dalla circolazione arriva ai muscoli, dove va a sistemarsi nelle giunzioni neuromuscolari

e esplica l'azione tossica. Esistono altri due tipi di intossicazione da botulino: botulismo da ferita e

botulismo infantile.

Tossina tetanica e botulinica: confronto

• La tossina botulinica è simile per struttura e funzione a quella tetanica (sono entrambe

tossine del tipo A-B)

• Hanno un target comune come la sinaptobrevina (VAMP) coinvolta nell’impacchettamento

vescicolare

• Entrambe provocano idrolisi delle proteine target, blocco del rilascio del

neurotrasmettitore e paralisi

• La tossina botulinica permane nelle terminazioni nervose per molto tempo, mentre la

tossina tetanica è trasportata dal trasporto assonico retrogrado nel midollo spinale (quindi

nell'encefalo).

• La tossina tetanica agisce inibendo la trasmissione inibitoria cioè bloccando il rilascio di

glicina e GABA, mentre la tossina botulinica agisce prevenendo il rilascio di acetilcolina

• In entrambi i casi il recupero delle funzioni richiede la rigenerazione delle terminazioni

nervose

• La terapia per entrambi comporta la somministrazione di metronidazolo e vaccinazione (

nel caso del botulino si somministra l’antitossina trivalente A, B, E)

• In entrambi i casi i pazienti rimangono a rischio di un’infezione secondaria perché non si

sviluppano anticorpi

L’adenilato-ciclasi converte l’ATP in AMP-ciclico (cAMP), “secondo” messaggero che attiva diversi

geni e funzioni cellulari. La funzione dell’adenilato-ciclasi è regolata da due proteine dette proteine

G (che legano il GTP): la proteina G stimolatoria (Gs) attiva l’adenilato-ciclasi, la proteina G

inibitoria (Gi) inibisce l’attivazione dell’adenilato-ciclasi. La proteina G stimolatoria (Gs) è il

bersaglio della tossina colerica, che la immobilizza nello stato attivato, causando un significativo

(fino a 100 volte maggiore) aumento della quantità intracellulare di cAMP. La proteina G inibitoria

(Gi) è il bersaglio della tossina della pertosse. La Gi inattivata non è in grado di inibire l’adenilato

ciclasi, con conseguente aumento della quantità intracellulare di cAMP.

Esospore.

La spora matura ha degli involucri che conferiscono resistenza agli stress ambientali. L'involucro

più importante è la corteccia o cortex, perché conferisce le resistenze più importanti, ossia quella

all'innalzamento della temperatura e quella alle radiazioni (UV). Le spore sono fortemente

disidratate: il citoplasma ha una forte carenza d'acqua (più citogel, che citosol). La cortex è ricca di

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acido dipicolinico, nella forma salina di dipiconato di calcio che, insieme a proteine ricche di ponti

disolfuro, conferisce la resistenza tipica dell'involucro. Esistono poi altri rivestimenti, dette

tuniche, e un rivestimento esterno detto esosporio. Segue poi, al di sotto delle tuniche, la

membrana citoplasmatica.

Esotossina difterica. (pantropa. Clostridium diphterioe. A+5B)

Tossina che inibisce la sintesi proteica. Si tratta di esotossine dimeriche AB. Con attività ADP-

ribosilante, con bersaglio il fattore di allungamento 2, EF2, che viene legato dal componente A

enzimatico all'ADP-ribosio e bloccato. Non essendoci più sintesi proteica c'è morte cellulare.

L'infezione si contrae per contatto, non per inalazione: una volta ingerito, la spora va a posizionarsi

nell'orofaringe e prolifera. Una volta prodotta l'esotossina essa va in circolo, e si distribuisce a

tutto l'organismo. È una tossina pantropa, ossia in grado di riconoscere un gran numero di

recettori cellulari, grazie alla subunità B, e può quindi infettare un gran numero di cellule. In

pratica esplica la sua azione solo su cellule altamente metabolizzanti come quelle del fegato e del

sistema nervoso. L'esotossina difterica ha due meccanismi d'azione: una ADP-ribosilante, l'altra è

attuata da A nei confronti del GTP, che fornisce energia a EF2.

Bloccando l'idrolisi di GTP, blocca l'apporto energetico, impedendo qualsiasi azione al EF2, che al

contempo è bloccato dall'ATP-ribosio.

La tossicità è data da un controllo genotipico e da un controllo fenotipico. Il primo consiste in un

gene, il gene tox, che deriva da un profago, il fago β (batteriofago temperato). Il controllo

fenotipico controlla la sintesi dell'esotossina: il gene tox è un sistema operon, con un gene

regolatore, uno repressore e alcuni operatori. Il repressore dell'operon è attivato in presenza di

ioni ferro. La concentrazione intracitoplasmatica è essenziale per il buon funzionamento

dell'operone: se è alta, il repressore si attiva e non avviene la sintesi proteica.

Tossina di SHIGA. (pantropa, Shigella dyssenterioe, enterobatterio A+5B Gram-)

Anche ad azione citolitica indiretta. Inibisce la sintesi proteica. Dimero AB. Agisce sugli RNA

ribosomiali. La subunità A taglia l'rRNA 28s della subunità ribosomiale 70s della cellula eucariotica.

EF2 è quindi inibito indirettamente, perché non c'è la lettura del messaggero. Morte cellulare e

conseguente citolisi indiretta.

Esotossina pertussica. (pantropa, cocco bacillo, A+5B) Gram-

È prodotta da Bordetella pertussis. È una esotossina multimerica, con dimero A-B e ha un'attività

ADP-ribosilante, che si estrinseca sull'adenilato ciclasi. L'ADP-ribosio è trasportato alla proteina G-

inibitoria, che viene inibita. Questo legame impedisce quindi a G-i di agire da inibitore

sull'adenilato ciclasi, che continua a produrre AMP ciclico. L'effetto è uguale alla tossina colerica,

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ma il meccanismo è diverso. Il bersaglio della tossina è l'epitelio dell'apparato respiratorio.

Aumento della produzione di muco, broncospasmo.

A seconda del tipo cellulare interessato, l’aumento intracellulare di cAMP può causare:

- nell’epitelio respiratorio, l’aumento delle secrezioni respiratorie e della produzione di muco,

caratteristiche dello stato parossistico della pertosse (tosse, broncospasmo, dispnea);

- nei fagociti, riduzione della fagocitosi (chemotassi, engulfment, killing);

- nel sangue, un’aumentata sensibilità all’istamina e conseguente aumento della permeabilità

capillare, ipotensione e shock;

- nelle cellule nervose, può causare encefalopatia (genericamente una qualunque malattia

dell’encefalo)

Tossina colerica. (Vibrio Cholerae, Gram-, 2A+5B)

È una esotossina multimerica, ha 5 monomeri B e due monomeri A, che una volta nella cellula

ospite è idrolizzato in dimero. L'esotossina colerica è in grado di modificare il flusso di cationi e di

anioni nelle cellule della mucosa intestinale, determinando un loro riversamento nel lume

intestinale del tenue. C'è un'alta concentrazione di ioni all'esterno, quindi le cellule, per

compensare il potenziale osmotico, si disidratano e si rischia la morte (diarrea liquida, ettolitri di

acqua persi). Questa situazione si viene a verificare, perché l'esotossina colerica determina un

aumento della concentrazione del cAMP, grazie all'adenilato ciclasi (enzima). L'adenilato ciclasi è

un enzima cellulare (in questo caso) che sintetizza cAMP a partire da ATP. L'esotossina colerica ha

la subunità A che è in grado di agire indirettamente sulla proteina G-stimolatoria. L'enzima

adenilato ciclasi è stimolata e inibita da due proteine di tipo G che agiscono alternativamente.

L'esotossina colerica agisce con un meccanismo ADP-ribosilante (modifica il NAD): l'ADP-ribosio è

trasportato sulla proteina G-stimolatoria, che così è immobilizzata nella sua forma

metabolicamente attiva e continua ad indurre l'adenilato ciclasi, che a sua volta continua a

produrre cAMP. Quando uno dei componenti B, che svolgono tutti la stessa funzione, riconosce un

recettore cellulare gangliosidico, noto come GM1, non si forma l'endocita, ma viene direttamente

internalizzato dalla cellula della mucosa intestinale del tenue. Quando l'esotossina è internalizzata,

la parte B si stacca e libera la componente enzimatica A1 e A2. A1 va ad agire indirettamente

sull'adenilato ciclasi cellulare (A1 non è essa stessa un'adenilato ciclasi): l'enzima eucariotico che

sintetizza cAMP è controllato da due proteine G, una che stimola e una che inibisce; accade che A1

lega l'ADP-ribosio a G-stimolante, che viene mantenuta attiva, continuando a stimolare la

produzione di cAMP.

I gangliosidi, appartenenti alla classe generale dei glicolipidi, sono particolarmente abbondanti

nel cervello (in cui è presente il ganglio, da cui il nome) ma presenti anche in molti altri tipi di

tessuti. Contengono uno o più residui di acido sialico. Spesso si trova la sigla GM1, che sta per

"Ganglioside Monosialico di tipo 1", cioè si definisce GM1 un ganglioside in cui è presente una sola

molecola di acido sialico (monosialico).

Il ganglio è una struttura nervosa appartenente al sistema nervoso periferico, con l'aspetto di un

piccolo rigonfiamento rotondo o fusiforme, dato da un ammasso di pirenofori neuronali e posto

lungo il decorso dei nervi (nell'uomo e negli altri mammiferi). Si distinguono i gangli del sistema

neurovegetativo o viscerali e quelli sensitivi o encefalospinali. I primi fungono da stazione

intermedia nella trasmissione degli impulsi e contengono neuroni che trasmettono gli impulsi ad

altri elementi nervosi (neuroni postgangliari). I gangli sensitivi, invece, si trovano lungo il decorso

delle radici dorsali, nei nervi spinali e lungo il primo tratto di alcuni dei nervi cranici; in essi non

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avviene la ripetizione ma soltanto il transito degli impulsi nervosi, data la natura unipolare dei

neuroni contenuti in essi.

Mobilità: a volte è una caratteristica necessaria per raggiungere il sito d’infezione o contrastare il

tentativo dell’ospite di eliminare il patogeno. Ad esempio, la mobilità consente a V. cholerae di

opporsi alla peristalsi intestinale.

Fattori di invasione: sono fattori che favoriscono la diffusione dei patogeni all’interno

dell’organismo; idrolizzando componenti dei tessuti umani, favoriscono la penetrazione in

profondità. Emolisine, fosfolipasi e lectinasi sono simili alle esotossine, ma agiscono sulle cellule

vicine al sito d’infezione, non a distanza.

Fattori d’invasione Descrizione

Ialuronidasi Prodotta da stafilococchi, streptococchi e clostridi; depolimerizza il

tessuto connettivo idrolizzando l’acido ialuronico

Collagenasi Prodotta dai clostridi (es. perfringens), disgrega il collagene provocando

la gangrena gassosa (cancrena causata da microbi che producono gas e

tossine)

Neuraminidasi Prodotta ad esempio da Vibrio cholerae, attacca l’acido neuraminico

che unisce le cellule degli epiteli della mucosa intestinale

Strepto e Stafilochinasi Sono prodotte da stafilococchi e streptococchi. Le chinasi digeriscono la

fibrina e impediscono la coagulazione del sangue

Emolisine Enzimi in grado di lisare i globuli rossi o altre cellule (fagociti); sono

prodotte da stafilococchi, streptococchi e clostridi. Danneggiano le

membrane cellulari

Fosfolipasi Prodotte da C. perfringens; idrolizzano i fosfolipidi di membrana

provocando la lisi cellulare

Lectinasi Prodotte da C. perfringens; distrugge la lectina delle membrane cellulari

Coagulasi Prodotte da ceppi di Staphilococcus aureus; questi patogeni convertono

il fibrinogeno in fibrina provocando la coagulazione del sangue.

DNasi Prodotte da ceppi di S. aureus; degradano il DNA

I VACCINI.

Sono una delle possibilità per contrastare le infezioni.

Le esotossine batteriche possono essere trasformate in vaccini, in teoria tutte, ma in realtà solo

alcune sono efficaci, perché altre o non funzionano o funzionano male. Le esotossine possono

essere vaccini, perché sono proteine; esse devono essere modificate, trasformate in tossoidi o

anatossine: esotossine dalle quali sono stati rimossi i componenti enzimatici e mantenuti i

componenti antigenici. A è eliminata quindi, e B è mantenuta. Un'anatossina o tossoide è

una tossina batterica che, mediante trattamento con formaldeide, è stata privata del potere

tossico ma non di quello immunogeno, permettendole di conservare la sua capacità d'indurre la

produzione di anticorpi specifici neutralizzanti da parte dei globuli bianchi una volta introdotta

nell'organismo. Le tossine batteriche sono, infatti, il bersaglio principale della sieroprofilassi.

Profilassi: Le norme e i provvedimenti che si devono adottare, collettivamente o da parte di

singoli, per la difesa contro determinate malattie, spec. Infettive

Sieroprofilassi: La profilassi indotta con l'introduzione per via parenterale di sieri immuni

Ottenuta l'anatossina, il vaccino viene utilizzato per la vaccinazione. L'individuo così attiva il suo

sistema immunitario, produce anticorpi, in particolare anticorpi neutralizzanti, che sono in grado

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di riconoscere l'antirecettore B specifico (per il determinante antigenico specifico). Essendo stato

precedentemente vaccinato, il sistema immunitario dell'individuo è già in risposta secondaria, e ha

disponibili gli anticorpi specifici per il patogeno.

L'unica vaccinazione abolita nel 1977 per la specie umana è quella per il virus del vaiolo (Poxvirus);

sono però ancora presenti dei ceppi in alcuni laboratori. Il virus del vaiolo, Poxvirus, è un virus

dsDNA, che, al contrario di tutti gli altri virus a DNA, non ha bisogno di entrare nel nucleo per

replicarsi, ma è in grado di farlo nel citoplasma. Nel nucleocapside, infatti, oltre al genoma, sono

presenti anche gli enzimi virali per la replicazione e la maturazione. Si tratta di un virus con

envelope (involucro, pericapside).

Per l'epatite B e la poliomielite, che non hanno esotossine, si usa il virus stesso per la vaccinazione.

Haemophilius influenzae di tipo b (b si riferisce alla capsula) è l'agente eziologico della meningite.

La pertosse è sostenuta da un microrganismo batterico, Bordetella pertussis. Anche questo

batterio produce una esotossina, che può essere rimaneggiata a tossoide.

La rosolia è causata da un virus, che colpisce soprattutto gli individui di sesso femminile, vaccinati

in età prepuberale. Antibiotici e Chemioterapici

Meccanismo d’azione: interferiscono con funzioni essenziali specifiche del microrganismo.

Questi hanno una tossicità selettiva, ovvero:

• Assenza di bersaglio nella cellula eucariotica (es. parete)

• Minore affinità per il bersaglio nella cellula eucariotica poiché questa e la procariotica

hanno stessa funzione, ma strutture diverse (ribosomi)

• Differente permeabilità (tetraciclina: trasporto attivo nella cellula batterica)

Antibiotici: sono metaboliti secondari di basso peso molecolare, prodotti da batteri e funghi,

capaci di inibire, a basse concentrazioni (µg/ml), la crescita di altri microrganismi attivamente

metabolizzanti. Non sono prodotti genici; sono diversi dai disinfettanti quali antimicrobici tossici

ed attivi anche su cellule quiescenti.

Chemioterapici: farmaci prodotti per sintesi

Selettività: Idealmente, una sostanza ad azione antimicrobica dovrebbe avere effetto massimo

sulla cellula batterica e scarso o nullo sulle cellule umane. Alcune attività metaboliche della cellula

batterica differiscono significativamente da quelle delle cellule umane; le molecole ad attività

antibiotica o chemioterapica sfruttano queste differenze.

Antibiotici β-lattamici: meccanismo dell’azione battericida

L’evento finale dell’azione degli antibiotici β-lattamici è la lisi della cellula batterica. La lisi cellulare

non è solo la conseguenza dell’arresto della sintesi del peptidoglicano, ma anche il risultato

dell’attivazione di enzimi in grado di depolimerizzare il peptidoglicano stesso (mureina-idrolasi).

Anche se il ruolo fisiologico di questi enzimi non è ancora stato chiarito, essi potrebbero svolgere

un’attività nei processi correlati alla divisione cellulare; inoltre, non è nota la relazione esistente

tra inibizione dell’attività delle PBP e attivazione delle auto lisine. Alcuni dati suggeriscono che

l’esposizione dei batteri agli antibiotici β-lattamici comporti la perdita di un inibitore delle auto

lisine. Penicilline e cefalosporine

Penicilline: derivati dell’acido 6-aminopenicillanico (fusione di L-cisteina e D-valina)

Cefalosporine: derivati dell’acido 7-aminocecalosporanico; contengono un anello β-lattamico

24

Nelle diverse penicilline e cefalosporine viene sostituita la catena laterale; il legame tra il

carbossile e l’azoto dell’anello viene scisso tramite idrolisi dalle β-lattamasi (penicillinasi o

cefalosporinasi) con conseguente produzione di acido penicilloico inattivo.

β-lattamici, meccanismo d’azione: Legame tra Penicillin Binding Protein (PBP

Numerose molecole batteriche fanno legami di questo tipo: catalizzano l’incorporazione dei

precursori nel peptidoglicano e la formazione dei legami peptidici trasversali, regolando la

lunghezza delle catene glicaniche. Il legame con penicilline e cefalosporine, oltre a bloccare

l’attività transpeptidasica, determina l’attivazione di murein-idrolasi ed endopeptidasi con

conseguente blocco della sintesi che porta all’autolisi.

• Il legame degli antibiotici β-lattamici con la PBP-1 porta a lisi cellulare mentre cellule ovali

incapaci di riprodursi solo la conseguenza del legame con la PBP-2

• Le β-lattamasi vengono secrete al di fuori della cellula e devono essere costantemente

sostituite.

Inibitore delle β-lattamasi: Analoghi strutturali dei β-lattamici con modesta attività antibatterica,

ma in grado di legarsi irreversibilmente alle β-lattamasi, inattivandole

Antibiotici che inibiscono la sintesi proteica: Interazione con subunità ribosomiali 30S e 50S;

Se interagiscono con subunità libere si ha blocco iniziale della sintesi proteica; se invece

l’interazione avviene con subunità già legate si può avere o il blocco di allungamento o errori di

lettura.

Antibiotici attivi sulla prima tappa del metabolismo del peptidoglicano: La prima tappa avviene

nel citoplasma dove vengono sintetizzate le unità fondamentali della struttura portante del

peptidoglicano NAG e NAM.

Antibiotici attivi sulla seconda tappa del metabolismo del peptidoglicano: La seconda tappa della

sintesi del peptidoglicano avviene sulla superficie interna della membrana citoplasmatica dove l’N-

acetilmuramil peptide viene legato da un trasportatore lipidico che trasloca la subunità completa

all’esterno della membrana. La bacitracina inibisce la defosforilazione del trasportatore lipidico

legandosi al bactoprenolo-difosfato e bloccando la rigenerazione del bactoprenolo-monofosfato.

Questo è un polipeptide ciclico tossico per l’uso clinico umano, ma viene usato per trattamenti

topici e come additivo alimentare per ruminanti al fine di ridurre la produzione di metanolo nel

rumine. Resistenza agli antibiotici

• Intrinseca (naturale): insensibilità naturale di alcune specie batteriche nei confronti di

alcuni antibiotici e chemioterapici

o Mancata penetrazione della cellula

o Sistemi di efflusso specifici e aspecifici

o Enzimi inattivanti l’antibiotico (codificati da geni cromosomici)

o Assenza del bersaglio

Questa resistenza è una condizione di generale insensibilità ad un farmaco che si estende a tutti gli

stipiti di una data specie. Al microrganismo può mancare la struttura su cui agisce l’antibiotico

come avviene con i micoplasmi che sono privi della parete cellulare e quindi sono insensibili alla

penicillina. La struttura della parete cellulare o la membrana citoplasmatica di un microrganismo

possono essere impermeabili ad un antibiotico.

• Acquisita 6 9

o − 10 ).

Endogena o cromosomica: viene acquisita per mutazione (10

25

In questo caso si ha l’alterazione del bersaglio, della permeabilità (es. alterazione

porine) di solito nei confronti di un solo antibiotico o di antibiotici della stessa classe

(resistenza crociata). I mutanti di solito sono meno vitali, l’antibiotico li selezione, la

resistenza è reversibile in assenza di pressione selettiva.

▪ Costituisce solo il 10-15% di tutte le resistenze acquisite, ha bassa frequenza

di insorgenza.

▪ Si realizza tramite un’alterazione mutazionale spontanea dell’informazione

genetica cromosomica

▪ L’antibiotico esercita un’azione selettiva (seleziona i mutanti resistenti

inibendo le cellule sensibili)

▪ Gli stessi mutanti possono essere resistenti anche ad altri antibiotici con

caratteristiche simili (resistenza crociata o cross-resistenza)

▪ Si trasmette verticalmente tramite la discendenza da cellula madre a cellula

figlia

▪ Può essere: one-step (è sufficiente una sola mutazione per conferire un

elevato grado di resistenza) o multi-step (sono necessarie più mutazioni

perché possa instaurarsi come accade per le β-lattamine e per i macrolidi)

o Esogena o extracromosomica: Acquisita da plasmidi, trasposoni o per

ricombinazione genetica

▪ Costituisce il 90% di tutte le resistenze (alta frequenza di insorgenza)

▪ Si origina per acquisizione di nuova informazione genetica che deriva da altri

microrganismi e che penetra nella cellula mediante i meccanismi di

coniugazione, trasformazione e trasduzione

▪ Riguarda più antibiotici contemporaneamente (resistenza multipla)

▪ È a trasmissione orizzontale (tramite lo scambio genetico)

▪ Può essere trasferita anche a microrganismi appartenenti a specie differenti

(resistenza contagiosa)

▪ È dovuta a geni presenti su plasmidi o trasposoni (elementi genici mobili)

Elementi trasponibili: sequenze (trasposoni) che hanno la capacità da muoversi ad un sito all’altro

del cromosoma. Diversamente da altri processi coinvolti nella ristrutturazione genomica, per la

trasposizione non c’è nessuna omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore.

Cellule dell’immunità:

Queste cellule sono prodotte da due diversi tipi di organi:

• Organi Linfoidi Primari (centrali): sviluppo e maturazione dei linfociti

- Midollo Osseo

- Timo

• Organi e Tessuti Linfoidi Secondari (periferici): attivazione dei linfociti

- Linfonodi

- Milza

- Tessuto linfoide associato alle mucose (MALT)

- Tessuti linfoidi cutanei

Caratteristiche principali di queste cellule sono:

• Memoria: Il sistema immunitario risponde ad un particolare antigene estraneo in

maniera più efficace quando è già entrato in contatto con tale antigene una prima

volta. Le risposte immunitarie secondarie sono più rapide e più intense

26

• Specificità: Ogni cellula effettrice (linfociti) presenta, sulla sua superficie, un recettore

che riconosce un solo antigene o una porzione di esso (epitopo o determinante

antigenico)

• Diversità: Ogni individuo possiede un repertorio linfocitario costituito da un numero

molto elevato di linfociti per discriminare almeno per discriminare almeno 109 diversi

determinanti antigenici

• Tolleranza al self: Le cellule del sistema immunitario sono capaci di riconoscere,

rispondere ed eliminare antigeni estranei (non-self) senza reagire contro i componenti

antigenici del proprio stesso organismo (antigeni autologhi o self). Nel caso questo

accada si hanno patologie autoimmuni

• Auto-limitazione: Tutte le risposte immunitarie normali si esauriscono col tempo dopo

l’eliminazione del patogeno

Le citochine sono molecole proteiche prodotte da vari tipi di cellule e secrete nel mezzo

circostante di solito in risposta ad uno stimolo in grado di modificare il comportamento di altre

cellule inducendo nuove attività come crescita, differenziazione e morte. La loro azione di solito è

locale, ma talvolta può manifestarsi su tutto l'organismo. Le citochine possono quindi avere un

effetto autocrino (modificando il comportamento della stessa cellula che l'ha secreta), o paracrino

(modificano il comportamento di cellule adiacenti). Alcune citochine possono invece agire in modo

endocrino, modificando cioè il comportamento di cellule molto distanti da loro. Hanno una vita

media di pochi minuti. Più esattamente sono proteine di piccole dimensioni, prodotte dalle cellule

del sistema immunitario (macrofagi, linfociti) e non, ad azione autocrina, paracrina ed edocrina,

che trasmettono messaggi in grado di attivare funzioni specializzate come la riproduzione e la

differenziazione cellulare. Fanno parte di questo gruppo: le interleuchine (IL-1, IL-2, IL-10) i fattori

di crescita (GF), i fattori di trasformazione (TGF-β), gli interferoni (IFN-α, IFN-β, IFN-γ: proteine che

si legano alle membrane plasmatiche per indurre una risposta antivirale).

Le citochine sono generalmente delle proteine. Possono agire sulle cellule che le hanno prodotte,

e hanno quindi un effetto pleiotropico, oppure su cellule vicine o distanti.

Chemochine: citochine che inducono attività chemiotattica (attrazione per via chimica dei

monociti, polimorfonucleati, neutrofili, cellule NK e linfociti)

Per interleuchina 1 (IL-1) si intende una citochina secreta da vari tipi di cellule del sistema

immunitario tra cui macrofagi, monociti e cellule dendritiche, ma anche da fibroblasti e cellule

endoteliali. Deve il suo nome al fatto di essere stata la prima citochina a venire scoperta.

Questa proteina viene prodotta tra l'altro in risposta a infezioni batteriche (la sua produzione

viene stimolata soprattutto dall' LPS), alla presenza di TNF e dall'interazione delle cellule

produttrici con linfociti T - CD4positivi.

La IL-1 ha molteplici effetti a livello sia locale che generale nell'organismo tra cui quello di

favorire processi infiammatori in risposta ad infezioni batteriche quali vasodilatazione, crampi e

febbre. Stimola, inoltre, la produzione di prostaglandine da parte di vari tipi di cellule (muscolari,

epiteliali, ecc), la produzione di altre citochine quali IL-2 e l'attivazione e il reclutamento di altre

cellule del sistema immunitario. Attiva infatti l’endotelio vascolare inducendo l’espressione di

molte molecole di adesione. IL-1 viene definita come “pirogeno endogeno” perché causa febbre.

La vasodilatazione dei vasi sanguigni (per mezzo delle prostaglandine) favorisce la migrazione di

cellule immunitarie quali macrofagi e linfociti verso il sito di infezione. Inoltre l'espressione di

molecole di adesione nelle cellule dell'endotelio dei vasi sanguigni favorisce l'ancoraggio

dei leucociti alle pareti dei vasi stessi e la loro migrazione verso i tessuti.

27

Un'altra capacità di queste chemochine è quella di contribuire ad attivare linfociti T helper e alla

maturazione e all'espansione clonale (moltiplicazione di linfociti B in grado di riconoscere lo

stesso antigene) dei linfociti B. In caso di infezione sistemica, l'interleuchina 1 agisce in maniera

simile al TNF-alfa, stimolando la produzione nel fegato delle cosiddette proteine di fase acuta.

Oltre a stimolare processi infiammatori, l' IL-1 è in grado direttamente e autonomamente di

stimolare la febbre, anche in assenza di altri stimoli (antigeni batterici), ed è per questo conosciuto

come un pirogeno endogeno. Questa citochina si lega a recettori presenti nelle cellule endoteliali

dell'ipotalamo e sembra essere in grado di "resettare" il suo centro termoregolatore facendo

aumentare la temperatura del corpo provocando febbre. In queste condizioni la replicazione

batterica e virale diminuisce mentre la risposta immunitaria diviene più efficiente.

Il fattore di necrosi tumorale α ( TNFα ) è una citochina pleotropa (in grado di influenzare altre

molecole) coinvolta nell'infiammazione sistemica; viene prodotta principalmente dai macrofagi,

sebbene possa essere prodotta da Linfociti T CD4+, cellule NK, neutrofili, mastociti, eosinofili e

neuroni. Il principale ruolo del TNF è nella regolazione delle cellule del sistema immunitario ovvero

produce prostaglandine (PGE2-PGI1) con conseguente azione sugli endoteli vasali causando

vasodilatazione, ipotensione e shock emodinamico.

Il TNF, essendo un pirogeno endogeno, è capace di indurre febbre, morte apoptotica delle

cellule, cachessia (perdita di peso, atrofia muscolare), infiammazione . È capace di inibire

la carcinogenesi (creazione del cancro) e la replicazione virale e di rispondere in caso

di Sepsi (invasione di tessuti da parte di patogeni) attraverso la produzione cellulare di IL-1 eIL-6.

Difetti nella produzione di TNF portano ad Alzheimer, cancro e malattie infiammatorie croniche

intestinali. Provoca la stimolazione dei linfociti T, induce l’aumento del metabolismo proteico

(cachessia), rallenta il metabolismo del ferro ed agisce sul fegato con conseguente ipoglicemia.

Altre citochine oltre a IL-1 e a TNF-α possono essere:

• IL-6: provoca l’attivazione dei linfociti e l’aumento della produzione degli anticorpi.

• IL-8: è il fattore chimiotattico per i neutrofili, inoltre attiva i PMN (polimorfoniucleati:

granulociti)

• IL-12: attiva le cellule NK ed induce la differenziazione dei linfociti CD4+ in T

• PAF: fattore di attivazione piastrinica

I leucociti (dal greco λευκός: “bianco“ e κύτος: “cellula”) ovvero i globuli bianchi o WBC,

sono cellule del sangue. La funzione principale dei leucociti è quella di preservare l'integrità

biologica dell'organismo tramite l'attuazione di meccanismi di difesa diretti contro microorganismi

patogeni di varia natura (virus, batteri, miceti, parassiti) e contro corpi estranei penetrati

nell'organismo dopo aver superato le barriere costituite dalla cute e dalle mucose.

Il termine generico leucociti comprende popolazioni cellulari assai differenti tra loro:

• granulociti neutrofili

• granulociti basofili

• granulociti eosinofili

(l'insieme di queste tre categorie si definisce granulociti polimorfonucleati)

• monociti, dai quali derivano i macrofagi tissutali;

• linfociti, ulteriormente classificabili in diverse sottopopolazioni.

(l'insieme di queste due categorie si definisce agranulociti mononucleati).

28

I granulociti sono un tipo di globuli bianchi; sono così definiti poiché contengono delle

granulazioni nel loro citoplasma dalle cui affinità tintoriali dipende la loro classificazione. Queste

granulazioni assumono poco i coloranti acidi e basici nei neutrofili, mentre si colorano con

coloranti acidi negli eosinofili e con quelli basici nei basofili.

I granulociti sono anche detti leucociti polimorfonucleati (PML o PMN) per via della forma variabile

del loro nucleo cellulare. La maggior parte dei granulociti presenti nel sangue sono neutrofili: in

effetti, i termini "granulocita" e "neutrofilo" sono spesso usati in modo intercambiabile.

I granulociti neutrofili sono un tipo di leucocita del gruppo dei granulociti, il cui citoplasma

contiene granulazioni caratteristiche e un nucleo lobato, hanno funzioni di difesa dell'organismo

contro infezioni batteriche e fungine. Vengono chiamati neutrofili perché non incorporano

coloranti istologici, né acidi né basici. Il compito fondamentale di queste cellule è quello di

catturare e distruggere sostanze estranee mediante il meccanismo della fagocitosi che è più

efficace di quella dei macrofagi. (10-12 micron).

Sono abbondanti nel circolo sanguigno; non hanno mitocondri, ma ricavano energia dalle

abbondanti riserve di glicogeno del loro citoplasma (tramite la glicolisi producono energia anche

nelle condizioni di anaerobiosi che si stabiliscono nel focolaio infiammatorio). Non si dividono.

I granulociti basofili o mastleucociti sono un tipo di granulociti, globuli bianchi il cui

citoplasma contiene granuli basofili, che reagiscono alla tecnica di colorazione con ematossilina

eosina assumendo una caratteristica colorazione violacea. Sono deputati alla difesa dell'organismo

e, insieme ai mastociti, alle risposte allergiche. Rappresentano solo lo 0,5 -1% dei leucociti

(10 µm). Nel citosol sono presenti granuli basofili responsabili del colore scuro dei granuli che

contengono: eparina, istamina, PAF (fattore attivatorio delle piastrine), SRS-A (fattori chemiotattici

dell'anafilassi: shock anaflattico) e altri mediatori chimici dei processi infiammatori. I basofili

possiedono inoltre sulla loro superficie i recettori specifici per la porzione Fc delle IgE,

caratteristica essenziale per la loro attività. Vengono prodotti dal midollo osseo partendo da

cellule staminali mieloidi comuni agli altri granulociti, globuli rossi e piastrine.

I granulociti eosinofili sono un tipo di granulociti, globuli bianchi il cui citoplasma contiene granuli

che legano fortemente l'eosina (colorante di contrasto dell’ematossilina) dando un tipico colore

rosso-arancio ed hanno funzione di difesa dell'organismo, soprattutto da parte degli elminti.

Rappresentano il 2-4% dei globuli bianchi e presentano un recettore per le IgE. Aumentano nelle

infezioni parassitarie, nelle reazioni allergiche, ma anche nelle malattie del collagene, della milza e

del sistema nervoso centrale. Vengono prodotti dal midollo osseo partendo da cellule

staminali mieloidi comuni agli altri granulociti, globuli rossi e piastrine.

Una volta maturi, circolano nel sangue per 6-10 ore per migrare poi nei connettivi per concludere

il loro ciclo vitale di 8-12 giorni svolgendo le loro funzioni. Possedendo il recettore per le IgE,

svolgono un'azione nelle reazioni allergiche e nella difesa da parassiti ed elminti. Sono in grado di

internalizzare i complessi antigene-anticorpi (raramente) e di rilasciare mediatori per i processi

infiammatori (come la proteina basica maggiore) e l'uccisione dei microbi. I loro granuli

contengono anche mediatori delle reazioni allergiche.

I monociti sono i globuli bianchi più voluminosi (12-18 µm di diametro). Rappresentano il 6-8%

della popolazione leucocitaria; sono capaci di extravasazione leucocitaria. In seguito a stimoli

chemiotattici ed infiammatori, la cellula raggiunge il compartimento vascolare e, da questo, il

tessuto, dove matura in macrofago. 29

La monocitopoiesi rappresenta la successione di precursori che portano alla formazione del

monocito maturo; la produzione dei monociti avviene nel midollo osseo. Si può riconoscere

solamente uno stadio immaturo, rappresentato dal promonocito. Il promonocito è una cellula di

dimensioni relativamente grandi (10-15 µm) con citoplasma basofilo, un nucleo voluminoso,

pochi lisosomi, scarsa attività fagocitaria, un complesso di Golgi, attività perossidasica e pochi

recettori per la porzione Fc delle IgG. Successivamente si ha un aumento del numero dei lisosomi e

l'acquisizione della motilità. Il monocita, in seguito a stimolazione chemiotattica (le cellule si

muovono a seconda della concentrazione, della presenza o assenza di determinate sostanze

chimmiche) , viene rilasciato nel circolo sanguigno. Qui permane per un tempo massimo di 12 ore

per poi passare nel tessuto e maturare in macrofago. I monociti possono essere dunque

considerati cellule in transito.

Nel citoplasma è possibile osservare oltre a mitocondri, reticolo endoplasmatico, apparato di

Golgi e lisosomi, due tipi di granuli:

• i granuli primari, a comparsa precoce, contengono perossidasi (produzione di perossidi);

• i granuli secondari, a comparsa tardiva, contengono solamente catalasi (scindono l’acqua

ossigenata in acqua e ossigeno).

I macrofagi sono cellule mononucleate tissutali che appartengono al sistema dei fagociti. Di

quest'ultimo sistema fanno pure parte i granulociti neutrofili e i monociti. Essi svolgono un ruolo

molto importante nelle risposte immunitarie naturali e specifiche. La loro funzione principale è la

fagocitosi cioè la capacità di inglobare nel loro citoplasma particelle estranee, compresi i

microrganismi, e di distruggerle. Secernono inoltre citochine (IL-1, IL-8, TNFα, etc) ad attività pro-

infiammatoria e presentano l'antigene ai linfociti T. Oltre alla funzione di difesa espletata con la

fagocitosi di agenti estranei quali i microbi, i macrofagi svolgono un ruolo importante nel

complesso meccanismo delle risposte immunitarie. A seconda del comparto del sistema

immunitario nel quale si esplicano possono essere così riassunte:

• Nell'immunità innata:

o Fagocitosi dei microbi e distruzione degli stessi.

o Produzione di citochine capaci di richiamare e attivare altre cellule infiammatorie.

o Secrezione di enzimi e di fattori di crescita, p.e. fattore di crescita piastrinico, che

stimolano la crescita e l'attività dei fibroblasti e delle cellule endoteliali

contribuendo così alla riparazione dei tessuti lesi dall'infezione.

o Produzione, in corso di infezioni virali, di interferon-alfa, citochina capace di inibire

la replicazione virale e il diffondersi dell'infezione ad altre cellule sane.

• Nell'immunità specifica:

o Presentazione dell'antigene ai linfociti T.

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule specializzate nella cattura di antigeni (Ag). Le DC possono

internalizzare l'antigene e processarlo per la sua presentazione ai linfociti T, oppure mantenerlo

sulla loro superficie in forma nativa e disponibile ai linfociti B specifici per quel determinato

antigene.

I linfociti sono cellule presenti nel sangue che costituiscono tra il 20 e il 40% dei leucociti; hanno la

dimensione di 7-15 micrometri (piccoli linfociti fino a 8 micrometri e grandi linfociti da 9 in su), con

un nucleo rotondeggiante, un citoplasma scarso (si riduce a un sottile anello) e pochi granuli.

La cromatina risulta molto addensata e al microscopio elettronico è possibile distinguere

un nucleolo (contrariamente a quanto si pensasse precedentemente).

30

Come tutte le cellule del sangue, le cellule del sistema immunitario derivano da un precursore

comune a livello del midollo osseo

da esso originano due linee, una che dà origine agli eritrociti (che non sono argomento di questo

corso) e una che dà origine ai leucociti.

Da un progenitore mieloide comune prendono origine tutte le cellule dell’immunità innata:

granulociti (neutrofili, basofili ed eosinofili) e monociti/macrofagi (i macrofagi derivano dai

monociti e colonizzano i tessuti).

Da un progenitore linfoide prendono origine invece i linfociti T e B. Queste sono le cellule

responsabili della risposta immunitaria specifica.

1. Linea mieloide:

- cellule dell’immunità innata:

▪ Granulociti

▪ Monociti

▪ Macrofagi: Il ruolo dei macrofagi è simile a quello delle cellule dendritiche.

I Toll-like receptor presenti sulla membrana dei macrofagi sono in grado di

legare antigeni e attivare gli stessi ad internalizzare il patogeno per

processarlo ed esporlo alle cellule T-helper tramite MHC di classe II. Questo

consentirà ai linfociti TH1 di attivare i macrofagi stessi a fagocitare e

distruggere i patogeni stessi.

▪ Cellule dendritiche: Sono anche definite DC, sono cellule fagocitarie e il loro

principale ruolo è quello di catturare l'antigene nei tessuti e muoversi nei

tessuti linfoidi secondari dove si stabilizzano nelle aree T e presentano

l'antigene processato ai linfociti T naive. APC: cell presentino antigen; sono

circolanti, processano l’antigene.

2. Linea linfoide:

- cellule dell’immunità specifica

▪ Linfociti B: Anche i linfociti B sono in grado di processare gli antigeni. Il

legame anticorpo-antigene può non scatenare una risposta diretta, ma

causare solamente l'internalizzazione del complesso attivato. L'antigene

all'interno della cellula viene poi processato ed esposto per i linfociti T

helper che legandolo attivano a loro volta i linfociti B a produrre dosi

massicce di anticorpi causando l'opsonizzazione del patogeno che presenta

quell'antigene.

▪ Linfociti T

- cellule dell’immunità innata:

▪ Linfociti NK

Svolgono un ruolo molto importante nel sistema immunitario: sono la struttura portante della

nostra risposta immunitaria adattativa (ovvero specifica per un tipo di antigene).

I linfociti derivano dalla linea linfoide delle cellule staminali multipotenti presenti nel midollo

osseo e a seconda del luogo, all'interno dell'organismo, nel quale avviene la maturazione cellulare,

si ottengono due linee linfocitarie ben distinte: i linfociti B (dall'inglese bone marrow: midollo

osseo, poiché qui maturano) e i linfociti T (da timo). Il luogo di maturazione dei linfociti risulta

appunto diverso a seconda delle caratteristiche che questi hanno; il linfocita T infatti matura

31

pienamente nel timo, mentre i linfociti B e NK (Natural Killer, i nostri linfociti "ancestrali") hanno

piena maturazione nel midollo osseo, ovvero dove nascono.

Nel differenziamento linfocitario si possono individuare principalmente due fasi:

una fase antigene-dipendente e una antigene-indipendente.

Nella fase antigene-indipendente, che avviene negli organi linfoidi primari (midollo osseo e timo),

vengono inizialmente prodotti linfociti provvisti di tutti i recettori per ogni tipo di antigene;

successivamente, alla fine di questo processo, sono isolabili linfociti maturi che sono considerabili

come "vergini" in quanto saprebbero riconoscere l'antigene ma non lo hanno mai incontrato

direttamente.

Nella fase antigene dipendente, che si svolge negli organi linfoidi secondari (milza, linfonodi, ecc.),

vi è l'incontro tra l'antigene e il linfocita che possiede il recettore adatto.

A questo punto si formano due categorie di cellule:

• cellule della memoria, un pool di cellule capaci, in caso si ripresenti il patogeno, di

velocizzare moltissimo (per scatenare una risposta linfocitaria adatta a contrastare un

attacco patogeno sono necessari dai 3 ai 5 giorni circa) la risposta adattativa da affiancare

alla risposta innata;

• cellule effettrici, in grado esse stesse di combattere e distruggere il patogeno (esempio per

il linfocita B le plasmacellule)

Tutte le cellule della linea leucocitaria derivano da un unico progenitore staminale multipotente

riconoscibile dalla molecola CD34 (la cellula esprimente la proteina è indicata come CD34+).

I linfociti maturi sono riconoscibili in quanto esprimono 5 famiglie di recettori:

• i recettori per l'antigene,

• i recettori MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) codificano per proteine espresse

sulla membrana cellulare le quali hanno la funzione di farsi riconoscere da parte dei

linfociti T,

• recettori per fattori di crescita,

• recettori Homing (consentono al linfocita di essere indirizzato verso un organo linfoide

secondario oppure verso un organo specifico in cui vi è proliferazione di patogeni),

recettori di interazione tra cellula e cellula.

I linfociti B sono responsabili della risposta immunitaria umorale poiché generano anticorpi

specifici (maturazione) e la loro secrezione (allo stadio di plasmacellula) all'interno del sangue e/o

delle mucose. Necessitano in genere, per la loro proliferazione, di un'attivazione da parte di

un linfocita T helper. Una volta differenziati in plasmacelllule, producono anticorpi (Ac);

Il loro recettore per l’antigene è rappresentato da anticorpi fissati alla membrana cellulare.

I linfociti T sono i principali responsabili dell'immunità adattativa cellulo-mediata. Prendono il loro

nome dal timo, organo in cui migrano allo stato di precursori indifferenziati, per uscirne come

linfociti "naive" (vergini); definiti così perché sono in grado di riconoscere l’antigene, ma non sono

ancora entrati in contatto). Quando entrano in contatto nel contesto di una molecola MHC e di

un'opportuna costimolazione, il linfocita T viene indotto a proliferare clonalmente, per poi

maturare alla fase effettrice:

• citotossica, per i linfociti CD8 che hanno riconosciuto l'antigene su un MHC di classe I;

32

• helper (T helper 1 e 2) per i linfociti CD4 che hanno riconosciuto l'antigene su un MHC di

classe II.

I linfociti NK (Natural Killer), detti anche cellula NK, sono un tipo molto particolare di linfociti in

grado di lisare cellule infettate da virus o di produrre citochine per stimolare una risposta

fagocitaria. Sono sempre del tipo grande e costituiscono il 20% della popolazione linfoide.

Possiedono una elevata attività antitumorale e antivirale pur non essendo soggetti a espansione

genica. Il linfocita NK possiede due importanti recettori FCγR e NCR. Gli FCγR sono capaci di

riconoscere un patogeno mentre gli NCR sono capaci di uccidere indiscriminatamente. Per evitare

possibili complicazioni, i NK sono stati dotati dall'evoluzione di KIR (Killer Inibitor Receptors) in

grado, riconoscendo le molecole HLA di primo tipo, di evitare la morte cellulare quando non

necessaria. Non tutti i linfociti NK sono dotati di complesso NCR/KIR.

I fagociti (neutrofili e macrofagi) sono attratti nel sito dell’infiammazione, dove essi possono

incontrare ed uccidere i microrganismi. La risposta infiammatoria porta ad una aumentata

espressione nei vasi sanguigni locali di molecole di adesione (ELAM-1, ICAM-1) che legano i

fagociti, permettendo a queste cellule di passare nel tessuto circostante secondo il processo

conosciuto come diapedesi. Per diapedesi leucocitaria si intende l’extravasazione leucocitaria: è il

processo di extravasazione attraverso cui i leucociti migrano, attraversando le pareti dei vasi

sanguigni, in risposta a segnali chimici infiammatori. Questo fenomeno è necessario per

permettere ai globuli bianchi, normalmente presenti nel torrente circolatorio, di svolgere le loro

funzioni nei tessuti.

Di norma avviene solo nelle venule post-capillari dei tessuti in cui sta avvenendo l'infezione nelle

quali il flusso ematico è rallentato e quindi la possibilità dei leucociti di rallentare ulteriormente è

molto amplificata. L'unica eccezione in cui non è venulare è costituita dai capillari polmonari.

La maturazione linfocitaria è il processo mediante il quale i progenitori dei linfociti presenti nel

timo e nel midollo osseo si sviluppano in linfociti maturi. I capostipiti della maturazione linfocitaria

sono le cellule HSC (Hematopoietic Stem Cells) del midollo osseo e del fegato fetale, che danno

origine a tutte le cellule del sangue. Le HSC maturano nelle CLP (Common Lymphoid Progenitors),

che sono i progenitori dei linfociti B, T e NK. Da questa popolazione cellulare si staccano due linee

differenziative, una per i linfociti B e una per i linfociti T e le cellule NK. L'indirizzamento verso

l'una o l'altra linea dipende dalla stimolazione da parte di citochine e dall'azione di alcuni fattori di

trascrizione specifici. In particolare i CLP si differenziano in precursori dei linfociti T e NK grazie

all'azione del recettore Notch-1. I CLP si differenziano invece in linfociti B grazie all'azione dei

fattori di trascrizione E2A e EBF che inducono il fattore di trascrizione Pax-5, che trascrivono per

esempio i geni per le catene leggere e le proteine Igα e Igβ.

Questi processi sono totalmente indipendenti dall'antigene: ciascun clone linfocitario, prodotto

durante la maturazione, codifica un recettore differente da un altro clone indipendentemente

dalla presenza di antigeni che ne modulino lo sviluppo per cui i recettori esistono già prima

dell'incontro con il corrispondente antigene e non ne sono la conseguenza.

Gli antigeni sono sostanze estranee (non self) che possiedono determinanti antigenici o epitopi in

grado di stimolare il sistema immunitario (produzione di anticorpi o di cellule quali linfociti

specifici) ed in grado di reagire con tali prodotti. L’epitopo è quella parte dell’antigene che si lega

all’anticorpo

• Immunogenicità: capacità di stimolare il sistema immunitario

• Reattività: capacità di reagire con anticorpi o linfociti

33

Per essere antigeni le molecole devono avere una certa complessità chimica (eterogeneità) ed una

certa dimensione molecolare ad esempio le proteine vanno sopra i 10.000 Da mentre i

polisaccaridi sopra i 50.000. Lipidi e Acidi Nucleici (apteni) fungono da antigeni solo in certe

condizioni se legati a molecole più complesse definite carriers.

Responsabili del danno possono essere sia mediatori dell’ospite (pirogeni, sostanze vasoattive,

enzimi lisosomi ali) evocati da patogeni (virus, batteri) e loro prodotti, sia da fattori batterici di

virulenza (tossine, prodotti del metabolismo, enzimi degradativi, fattori virus specifici, patogeni).

Sono inoltre presenti i PAMPs, molecole prodotte esclusivamente dai batteri che hanno funzioni

uniche ed insostituibili nelle cellule che li producono; sono cioè “marcatori” dell’invasione

batterica. Sono soggetti a poche modificazioni durante la loro evoluzione perché il loro ruolo è

essenziale alla sopravvivenza batterica, sono cioè molto conservati all’interno di una specie

batterica. Gli eucarioti hanno sviluppato particolari recettori per i PAMPs, di solito abbreviati in

PRR (Pattern Recognitions Receptors).

Anticorpi o immunoglobuline

Gli Ab (antibiotici) o Ig sono complessi proteici a struttura modulare simile a una “Y” con notevoli

variabilità in specifiche regioni capaci di legarsi a particelle strutturalmente complementari

denominate antigeni (Ag). La produzione di anticorpi è la funzione principale del sistema immunitario

umorale

Gli Ab hanno la funzione, nell'ambito del sistema immunitario, di neutralizzare corpi estranei come

virus, batteri o tossine, riconoscendo ogni determinante antigenico o epitopo legato al corpo

come un bersaglio. Insieme ai TCR e ai MHC sono le uniche molecole capaci di legare l’Ag

Dal momento che la molecola originale pesa 150 KDa e chiaramente formata da due catene

pesanti e due catene leggere tenute assieme da legami S-S .

Digestione proteolitica con specifici enzimi

Papaina: (enzima proteolitico, appartenente alla classe delle idrolasi, che si estrae dal frutto

immaturo della papaia) le Ig vengono tagliate in 3 frammenti costituiti dai due bracci e dal gambo.

Due di questi sono identici e costituiti dalla catena leggera ancora legata ad un pezzo di catena

pesante. Dal momento che la capacità di legare l'antigene è mantenuta vengono chiamati

Fragment Antigen Binding (Fab). Il terzo frammento è composto dalle parti restanti delle catene

pesanti che tendono ad aggregarsi e a cristallizzare; vengono per questo chiamati Fragment

crystallizable (Fc)

Pepsina: si genera un solo frammento F(ab')2 costituito dai due Fab legati insieme. La restante

parte dell'immunoglobulina non genera un Fc, ma piccoli frammenti peptidici.

Regione V: Le regioni variabili di entrambe le catene contengono le regioni ipervariabili, che

donano a ciascun Ab la specificità unica verso un antigene, costituite dalle 3 anse che collegano i

nastri adiacenti dei foglietti-β. La caratteristica di variabilità, solo in specifiche regioni, consente

alle Ig di avere una struttura di base costante.

Regione C:

• 1 dominio Ig nelle catene leggere (CL)

• 3-4 domini Ig nelle catene pesanti (CH1,2,3,4)

34 Differenze presenti nella regione

costante delle catene pesanti:

-forma secreta

-forma di membrana: presente una

regione idrofobica ad α-elica

transmembranale e una regione carica

positivamente all'interno della cellula

-Sintetizzate da uno stesso cromosoma

per splicing alternativo

La regione compresa fra i domini CH1 e CH2, detta regione cerniera (Hinge), caratterizzata da

elasticità di movimento e permette un diverso orientamento (fino a 90 gradi) dei bracci in modo

da poter legare più antigeni contemporaneamente

Esistono diverse classi di anticorpi o immunoglobuline (Ig) che differiscono per struttura,

frequenza relativa nel circolo sanguigno e attività biologiche.

• IgG: sono le più abbondanti nel sangue e nei liquidi tissutali (80% delle Ig totali). Possono

attraversare la placenta

• IgM: (6% delle Ig totali); sono formate da 5 monomeri e sono le prime nel sangue ad essere

prodotte in risposta ad un antigene

• IgA: (13% delle IG totali); sono abbondanti nel muco dell’apparato digerente e respiratorio,

nel colostro, nel latte e nelle lacrime in forma dimerica. Nel sangue si formano in forma

monometrica

• IgD: sono rare nel sangue e nei liquidi tissutali (1% delle Ig totali); sono i recettori di

membrana dei linfociti B

• IgE: sono presenti nel sangue in piccolissima quantità (0.002% delle Ig totali). Mediano

reazioni allergiche e vengono prodotte in risposta ai parassiti

Le IgA sono prodotte e trasportate attraverso gli epiteli sulle superfici mucose in contatto con

l’ambiente esterno. La maggior parte delle IgA è sintetizzato da plasmacellule localizzate sotto la

membrana basale degli epiteli (intestinale, respiratorio) o nelle ghiandole mammarie e salivari. Si

diffondono verso la membrana basale legandosi ad una particolare proteina di trasporto (poly-Ig

receptor). Le IgA, per transcitosi, passano attraverso la cellula epiteliale in un vacuolo circondato

da membrana. Al polo apicale il poly-Ig receptor subisce un taglio proteolitico; la IgA viene

rilasciata nel lume attaccata alla “componente secretoria”.

35

La risposta primaria si divide in: fase di latenza (5-10 giorni), fase esponenziale (7-10 giorni), fase di

plateau e declino rapido. La risposta secondaria invece è più rapida (3-5 giorni), richiede una

quantità maggiore di Ig, una quantità minore di Ag e persiste più a lungo.

Gli anticorpi hanno quindi tre funzioni:

1. Neutralizzante:

a. Azione di tossine: Legandosi alle tossine batterica, gli Ac impediscono che queste si

leghino ai loro recettori cellulari

b. Infettività virale: legandosi ai virus, gli Ac impediscono a questi di legarsi ai loro

recettori cellulari

c. Adesione ai tessuti: legandosi alla superficie batterica, gli Ac impediscono la fase di

adesione e quindi di colonizzazione

2. Opsonizzazione: Un batterio rivestito di Ac viene attivamente fagocitato dai macrofagi che

hanno dei recettori superficiali che si legano alla regione Fc delle molecole IgG. Il legame

del batterio ricoperto da Ac con questi recettori Fc sul macrofago attiva il processo di

fagocitosi. consiste in un insieme molto complesso di proteine sieriche che

Attivazione del complemento:

partecipano in vario modo alla difesa dalle infezioni. I componenti del complemento per poter

svolgere le loro funzioni devono essere "attivati"; l'attivazione di questi avviene secondo una

sequenza "a cascata".

Questo complesso rende i microrganismi invasori suscettibili alla fagocitosi anche in assenza di

anticorpi; lisa direttamente alcuni microrganismi, virus o cellule. Alcuni componenti del

complemento esercitano un'azione chemiotattica su altre cellule del sangue.

Gli Ab si legano solo a specifiche parti degli antigeni denominati determinanti o epitopi.

Nel caso delle proteine, costituite da più livelli di organizzazione, esistono due tipi di determinanti:

• determinanti lineari: riconoscono la struttura primaria

• determinanti conformazionali: riconoscono la struttura terziaria

Le macromolecole possono contenere più determinanti, anche ripetuti, e la presenza di tali epitopi

uguali viene definita polivalenza

Ab e Ag formano un immunocomplesso: esiste una precisa concentrazione detta zona di

equivalenza in cui quasi tutti gli Ab sono legati con la quasi totalità degli Ag. Si viene a formare un

grosso reticolo molecolare che se accade in vivo può portare a pesanti reazione infiammatorie

dette malattie da immunocomplessi. Naturalmente aumentando le molecole di Ag o Ab si sposta

l'equilibrio e i grossi complessi si rompono.

• Specificità: capacità di discriminare l’Ag da molecole chimicamente e strutturalmente

molto simili all’Ag stesso

• Affinità: la forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un singolo Ag. Una maggiore

affinità (espressa in termini di costante di dissociazione) significa che basta una bassa

concentrazione dell’Ag perché il legame avvenga

• Avidità: la forza del legame tra un Ab e un Ag polivalente (permette più legami con lo

stesso Ab), data dalla somma di tutti i legami che possono essere effettuati. L’avidità può

essere incrementata aumentando il numero di siti di legame o l’affinità dei siti di legame

stessi

• Neutralizzazione: permette la neutralizzazione del patogeno o dei suoi prodotti

semplicemente legandosi ad esso

• Opsonizzazione: permette al fagocita di fagocitare la cellula bersaglio

• Fissazione del complemento: a seconda della Ig prodotta questa sarà più o meno capace di

fissare molecole del complemento che possono portare alla lisi della cellula bersaglio

36

• Citotossicità Ab dipendente: gli Ab rendono riconoscibili gli Ag alle cellule NK, che

distruggono le cellule infette o alterate, e agli eosinofili, che con la loro degranulazione

attaccano soprattutto i parassiti

Recettore Fc neotonale: è un recettore legato alla lunga emivita che presentano le IgG rispetto alle

altre classi. Inizialmente è coinvolto nel trasporto di IgG dalla placenta all'intestino del feto; nella

vita adulta, invece, si posizionano sulla superficie delle cellule endoteliali. Hanno una struttura

simile alle MHC, ma senza tasca legante il peptide. La principale funzione è quella di legare le IgG

entrate nelle cellule a livello degli endosomi, qui le trattiene impedendo che vengano degradate e

poi rilasciate non appena il recettore viene riespresso sulla membrana.

Superantigeni:

Ci sono delle esotossine che agiscono da superantigene: funzionano in un modo tale da impedire

all'organismo di produrre anticorpi. In definitiva queste tossine sono in grado di alterare la risposta

di difesa adattativa: normalmente quando l'individuo produce anticorpi (i linfociti T helper (TH1)

contattano e attiva il macrofago, che compie fagocitosi etc); quando è presente il superantigene,

queste strutture sono in grado di legare da una parte l'MHC-II (riconoscimento antigeni da parte

del sistema immunitario) e da una parte il TCR (recettore dei linfociti T), impedendo così la

risposta dei macrofagi e dei linfociti T. Più precisamente, i superantigeni si mettono a ponte e

legano le due cellule, tenendo così lontani i recettori. Ci sono dei casi in cui la risposta è solo

alterata e altri in cui è totalmente inibita. Quando la risposta è alterata il linfocita T comincia a

produrre interleuchina 2 e interferone gamma in quantità eccessive. Tutto questo porta a febbre,

infiammazione, aumentata permeabilità vascolare, ipotensione e in fine shock tossico da

superantigene. I principali effetti dannosi sono relativi al rilascio di citochine; in questo caso è una

tossina eritrogenica prodotta da Streptococcus pyogenae. Esistono poi altre tossine

superantigeniche prodotte da S. pyogenae aureae (enterotossina) e da M. tubercolosys, nonché

HIV e virus rabbico. I superantigeni sono proteine batteriche ad azione toxin-like che attivano le

cellule T CD4+ legandosi aspecificamente (senza presenza di Ag specifico) al T cell receptor (TCR)

ed al complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC-II) dei macrofagi. L’interazione

aspecifica APC-linfocita T mediata dal superantigene si traduce nella attivazione e proliferazione

delle cellule T e nell’attivazione dei macrofagi con rilascio di elevate dosi di diverse citochine:

dapprima IL-2 (febbre, nausea, vomito, diarrea) che, a sua volta, stimola la sintesi di altre citochine

(IL-1, IL-8, TNF-α, PAF) coinvolte nella patogenesi dello shock (danno endoteliale, CID, insufficienza

respiratoria).

Processamento dell'antigene

La processamento dell'antigene (in inglese APM, Antigen Processing Machinery), è il principale

ruolo delle APC che, una volta catturato l'antigene, lo modificano per esporlo tramite le molecole

MHC ai linfociti.

Tipi di processmento

Esistono fondamentalmente due tipi di processamento dell'antigene che dipendono dalla modalità

con cui questo viene catturato dalle APC:

- prodotti di origine citoplasmatica → espressione su molecole MHC I → Attivazione

di Linfociti T CD8+;

- prodotti di origine extracellulare → espressione su molecole MHC II → Attivazione

di Linfociti T CD4+.

Questa apparente sottile differenza è alla base di una iniziale specificità di risposta che dipende

dalle diverse funzioni effettuate dai linfociti T che legano una o l'altra classe di MHC.

37

Molecole MHC di classe I

Si legheranno alle MHC di classe I i peptidi presenti nel citosol. Questi possono essere prodotte da

virus o microbi che hanno infettato la cellula, da geni mutati nelle cellule tumorali oppure da

proteine di microbi o virus fagocitati ma che sono finiti nel citoplasma. È questo il caso di microbi

che si sono evoluti per evitare di morire per fagocitosi e hanno sviluppato metodi,come la

costruzioni di pori nelle vescicole, per riversarsi e riversare prodotti nel citosol. Ne è un esempio

la Listeria monocytogenes che produce una proteina, la listeriolisina, capace di far uscire i batteri

dalle vescicole. In altri casi, alcune DC possono utilizzare antigeni presenti nelle vescicole (e quindi

destinati alle MHC di classe II) in un fenomeno conosciuto come cross-presentazione.

Una volta nel citoplasma le proteine vengono degradate (dal proteasoma, da proteasi specifiche,

con il reticolo endoplasmatico) in peptidi più piccoli di grandezza ideale per i legame con le MHC di

classe I (una lunghezza di 8-11 amminoacidi). La tappa successiva è il trasporto nel reticolo

endoplasmatico dove sono presenti le molecole MHC tramite iltrasportatore associato con la

processazione dell'antigene TAP (Transporter Associated with Antigen Processing) che è

specializzato nel trasportare peptidi di 8-16 amminoacidi. Nel lume del RE TAP è associato con

la tapasina che lo avvicina alle molecole MHC di classe I vuote permettendo il legame con il

peptide che nel frattempo è stato ulteriormente adattato da ERAP (Endoplasmic Reticulum Amino-

Peptidase). Una volta avvenuto il legame peptide-MHC si perde l'affinità con la tapasina e il

complesso MHC può essere trasportato sulla superficie cellulare (attraverso il Golgi e il sistema di

esocitosi). Il peptide è essenziale per la riuscita di quest'ultimo passaggio perché le due sole catene

che costituiscono la molecola MHC di classe I (vedi struttura delle MHC di classe I) sono instabili e

non riescono ad essere trasportati finendo per essere degrati del citosol.

Proteasoma

Una delle vie di degradazione classiche nella cellule è costituita dal proteasoma. Le proteine che

devono essere eliminate vengono legate con ubiquitina che le indirizza nel proteasoma, un

complesso proteico con capacità proteolitiche. Sembra che nella via dell'MHC di classe I

intervengano proteasomi più complessi rispetto a quelli normalmente utilizzati per la

degradazione proteica. Si tratta di organelli dalla forma cilindrica, cavi, del peso di 1,5 kDa e

costituiti da due anelli α esterni e da due anelli β interni. Gli anelli esterni sono strutturali, mentre

β1, β2 e β5 (3 delle 7 subunità interne) hanno attività proteolitica. Le proteine ubiquitinate sono

riconosciute dagli anelli esterni del proteasoma, perdono la loro struttura ripiegata e vengono

costrette ad entrare nel tunnel dell'organello in forma svolta. Due subunità catalitiche, dette LMP-

2 e LMP-7, sono fondamentali per la funzione del proteasoma e sono codificate nella stessa

regione dove si trovano i geni per MHC. Esse degradano la proteina antigenica in corti peptidi di 6-

30 amminoacidi che possiedono caratteristicamente residui idrofobici o basici al C-terminale.

L'espressione di queste è aumentata da IFN-γ (una citochina secreta dai linfociti T attivati e

potente attivatrice dei macrofagi).

Molecole MHC di classe II

I peptidi che si legano con le molecole MHC di classe II provengono da antigeni endocitati e quindi

contenuti in vescicole. La prima tappa è il legame dell'antigene con la APC che ne determina la

fagocitosi. Le APC presentano sulla superficie cellulare svariati recettori (per lo più facenti parte

dell'immunità adattativa come i Toll-Like Receptors) che legano e provocano l'internalizzazione

dell'antigene. All'interno delle vescicole il pH acido attiva le catepsine delle proteasi che

degradano gli antigeni. Molte proteine vengono prima legate alle molecole MHC e poi tagliate in

peptidi. Esistono all'interno dei macrofagi e dei linfociti B delle vescicole ricche di MHC di classe II

denominate compartimenti MHC di classe II'o MIIC che hanno un ruolo essenziale nella

presentazione dell'antigene. 38


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biologia
SSD:
Università: Parma - Unipr
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ari_kokoro di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia, immunologia e virologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Parma - Unipr o del prof Conti Giorgio.

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