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 Aumenta l'espressione di molecole di adesione sulla superficie delle cellule endoteliali vascolari,

perciò fa "stravasare" i leucociti dal sangue nel sito di infezione

 Attiva i leucociti stravasati

 Stimola fagociti mononucleati a produrre CHEMOCHINE, le quali contribuiscono al "Reclutamento

Linfocitario"

 Co-stimolazione dei linfociti T e produzione di immunoglobuline

 Stimola sintesi di CSF

 Aumenta l'espressione di molecole MHC classe I

 Ha un ruolo nel rimodellamento tissutale: agisce come fattore angiogenetico per la neoformazione

di capillari, e come fattore di crescita per i fibroblasti favorendo la deposizione di tessuto connettivo.

Effetti Sistemici: ad alte dosi

 Si comporta da ormone

 E' un PIROGENO ENDOGENO, agisce sulle regioni regolatorie dell'omeostasi termica nell'ipotalamo

inducendo la sintesi di prostaglandine che provocano un innalzamento del set-point ipotalamico, e

quindi ipertermia.

 Stimola i fagociti mononucleati a produrre IL-1 e IL-6. (Cascata di Citochine indotta da TNF).

 Stimola gli epatociti a produrre le Proteine di Fase Acuta

 Attiva la Coagulazione

 Inibisce la replicazione delle cellule staminali del midollo osseo (la somministrazione cronica di TNF

può quindi indurre immunodeficienza)

Somministrazione Prolungata:

 Soppressione dell'appetito

 CACHESSIA: distrugge progressivamente adipociti e cellule muscolari. Il TNF veniva infatti chiamato

"cachessina" per indicare questa sua caratteristica.

Il TNF è un importante target per lo sviluppo di nuovi farmaci antinfiammatori. Utilizzo di anti TNF (anticorpi

o recettori solubili) sono ormai terapia standard di patologie su base autoimmune con danno tessutale ad

esempio: artrite reumatoide. È una patologia delle articolazioni autoimmune, dove i linfociti e i macrofagi

distruggono progressivamente la cartilagine e l’osso. Il TNF è il fattore che orchestra tutta la risposta

autoimmune all’interno dell’articolazione. Si sono sviluppati anticorpi contro il TNF, dove il primo ad essere

stato sviluppato è l’Infiximab e successivamente umab, che legano il TNF, portando ad una diminuzione di

tutti i danni indotti dalla malattia. Hanno sviluppato un recettore solubile, Etanercept, che assomiglia al

recettore del TNF in modo da sequestrare il TNF in circolo che non si lega più alle cellule. Si teme che a

seguito di diminuita attività del TNF si possa avere una riattivazione della tubercolosi. Inoltre, si è visto che

diminuendo l’attività del TNF potrebbe aumentare l’incidenza dei tumori, ma dalle evidenze sperimentali si

è notato che non sembrerebbe direttamente collegato.

L’interleuchina 1 e’ prodotta da: Monociti / Macrofagi, Cellule dendritiche e Altre cellule ( cell. epiteliali,

cheratinociti, sinoviociti, glia, neuroni etc..). In risposta a: LPS (endotossina dei Gram negativi), TNF (vedi

"Produzione a Cascata delle citochine Proinfiammatorie"), IL-1 stessa, Contatto con linfociti T CD4. L’IL-1 è

prodotta da diversi tipi cellulari, (es. cellule endoteliali, epiteliali), così che questa citochina può essere

prodotta da Sorgenti Locali, anche in assenza di macrofagi. Esistono due forme di IL-1, denominate IL-1 a e

IL-1 b, prodotte rispettivamente da due geni diversi. Hanno una omologia strutturale del 30%, ma la loro

attività biologica è praticamente identica. Entrambe sono sintetizzate come precursori di 33 kd,

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successivamente clivate proteoliticamente (ICE/CASPASI) per ottenere la forma matura di 17 Kd. Sia IL-1 a

che IL 1 b si legano agli stessi recettori di membrana. Vi è poi una terza molecola, prodotta dai Fagociti

Mononucleati, strutturalmente omologa a IL-1 (e quindi in grado di legarsi ai suoi stessi recettori), ma

funzionalmente inattiva. Essa agisce quindi da inibitore competitivo di IL-1 e viene detta IL-1 RA (cioè IL-1

Receptor Antagonist). Azioni della il-1 a basse dosi:

 favorisce infiammazione locale

 agisce sulle cellule endoteliali favorendo la coagulazione

 aumenta l’espressione di molecole di adesione

 provoca il rilascio di chemochine che reclutano altri leucociti sul luogo dell’infiammazione

 stimola la proliferazione dei CD 4+

 stimola la crescita e il differenziamento dei linfociti B

 stimola molte cellule effettrici a rispondere

Azioni della il-1 ad alte dosi:

 entra nel circolo ematico, ed agisce quindi con un meccanismo di tipo endocrino

 è un pirogeno endogeno

 stimola la sintesi di proteine di fase acuta

 induce cachessia

Kineret® (anakinra) è una forma ricombinante non glicosilata dell'antagonista del recettore

dell'interleuchina-1 umana (IL-1Ra). Kineret® differisce da IL-1Ra umano nativo in quanto ha l'aggiunta di un

singolo residuo di metionina al suo terminale amminico. Kineret® è costituito da 153 aminoacidi e ha un peso

molecolare di 17,3 kilodalton. È prodotto dalla tecnologia del DNA ricombinante utilizzando un sistema di

espressione batterica di E coli. 17

21/03/2018

TK inibitorie

I sistemi di fosforilazione nella cellula sono molto importanti per il signaling. Gli enzimi che sono deputati

alla defosforilazione sono le proteine chinasi e sono ubiquitarie e importanti nella via di trasduzione del

segnale e segnale che trasportano informazioni dallo spazio extracellulare o intracitoplasmatico al nucleo,

influenzando quindi la trascrizione di geni e/o la sintesi del DNA. Si dividono in tirosin chinasi che: fosforilano

solo I residui di tirosina, serina-treonin-chinasi e chinasi con attività sui 3 residui. Ad oggi tra gli enzimi più

studiati e più modulati dai farmaci sono le TK che catalizzano il trasferimento di un gruppo fosfato dell’ATP

al residuo di tirosina sia all’interno della stessa chinasi (autofosforilazione) o in altre proteine a valle della via

di trasduzione. Si dividono in due grandi famiglie a seconda della localizzazione: recettori a TK, hanno un

dominio extracellulare che lega un ligando (fattori di crescita) e TK intracitoplasmatiche. Le TK

intracitoplasmatiche la cui attivazione è a valle di un signaling che arriva all’interno della cellula. L’attività

chinasica è fondamentale per molte funzioni cellulare, in particolare nella proliferazione, sopravvivenza e

differenziazione cellulare. Vengono studiate in quanto sono state tra le prime molecole mutate in forme di

leucemia (ma anche tumori solidi) e le

cellule leucemiche sono dipendenti

da queste forme aberranti di TK per la

loro sopravvivenza. L’importanza nel

modulare farmacologicamente

l’attività delle tk con una serie di

inibitori nasce proprio da questo

fatto. Si deve cercare di bloccare solo

le tk alterate senza modificare

l’attività delle altre tk. TK catalizzano

il trasferimento di un gruppo fosfato

dall’ATP al residuo di tirosina Sia

all’interno della stessa chinasi

(autofosforilazione) o in altre

proteine a valle della via di

trasduzione. A livello strutturale una

tk è costituita da una regione superiore e una regione inferiore che vengono definiti rispettivamente in N-

lobe, C-lobe e il sito specifico per l’ATP dove avviene la fosforilazione della chinasi stessa e la sua attivazione.

Successivamente i gruppi fosfato vengono ceduti al substrato. quando arriva il ligando, la tk cambia

conformazione dimerizzando a autofosforilandosi, portando all’attivazione della cascata del segnale.

Esistono una serie di TK oncogeniche che funzionano in modo costitutivo, ossia sono sempre attive anche in

assenza di segnale. Sono riconosciuti quattro meccanismi principali che determinano trasformazione

oncogenica delle PTKs. Il primo è un meccanismo di trasformazione comune in roditori e polli, legato ad una

trasduzione retrovirale di un oncogene corrispondente ad una PK strutturalmente alterata, che possiede

attività deregolata. Ricordiamo per esempio la perdita della funzione regolatoria negativa in v-src o in v-abl.

Il secondo è causato da un riarrangiamento genomico, come una traslocazione o un’inversione

cromosomica. Questi riarrangiamenti, che portano alla fusione di un gene codificante per una proteina

contenente domini di dimerizzazione con il gene che codifica per una tirosin-chinasi (viene mantenuta

l’attività catalitica), spesso determinano la produzione di una proteina di fusione costitutivamente attivata,

come accade nella formazione di BCR/ABL nella leucemia mieloide cronica. Il terzo meccanismo prevede la

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perdita della regolazione della proteina mediante mutazioni puntiformi. Infine, il quarto meccanismo di

amplificazione genica può determinare la overespressione di PTKs con conseguente sviluppo di attività

oncogenica, meccanismo spesso associato a molti tumori umani. Importante esempio sono neu/erbB2 e

EGFR che sono spesso amplificati in carcinomi polmonari e/o toracici

La LMC è una malattia del sangue che non porta alla morte repentina. Nella leucemia mieloide cronica LMC

esiste un cromosoma chiamato philadelfia che deriva dalla traslocazione tra il cromosoma 9 e il cromosoma

22 ph= t(22,9) che determina la formazione di un gene di fusione tra il gene BCR e il gene ABL. Il gene ABL è

una PK non recettoriale (cromosoma 9) viene traslocato sul gene 22, I primi 13-14 esoni di BCR si uniscono

ad ABL. La porzione di BCR controlla la trascrizione dei geni di fusione e possiede un dominio per la

oligodimerizzazione. ABL mantiene tutta la capacità di fosforilare. La proteina di fusione ABL-BCR quindi

dimerizza, si autofosforila ed è quindi sempre attiva, portando ad un elevata stimolazione del signalling

attraverso la stimolazione di RAS/MAPK e STAT. Affinché la tk sia attiva deve dimerizzare e in BCR-ABL, BCR

è un forte segnale di dimerizzazione portando ad un’attivazione costitutiva causando l’attiva proliferazione

delle cellule. Si è pensato di bloccare BCR-ABL, ma esistono problemi di specificità che però sono tipici solo

del tumore, in modo da non interferire con le altre tk dell’organismo. Inoltre, bisogna capire con quale tipo

molecolare bloccare e che tipo molecolare sviluppare. Sono state sviluppate molecole a basso peso

molecolare in grado di attraversare il doppio strato fosfolipidico della membrana citoplasmatica e di

interferire con l’attività catalitica, che consiste nel trasferimento di un fosfato dall’ATP al gruppo ossidrilico

della catena laterale di una tirosina. La molecola sviluppata prende il nome di Imatnib (nome commerciale

Gleevec) che blocca la fosforilazione. La specificità non è completa ma comunque molto elevata, infatti

vengono colpiti anche p-190, p-210, C-kit. Questo farmaco ha rappresentanto per la farmacologia un

successo grandissimo, dove si ha una risposta ematologia del 96%. Si assiste, però, allo sviluppo di molecole

resistenti al Gleevec causate ad una resistenza genetica dovuta a mutazioni diverse a livello del sito catalitico.

Nel tempo, inoltre, possono indursi delle ulteriori mutazioni geniche che possono impedire il legame di

Imatibib. Sono state identificate tutta una serie di mutazioni puntiformi che sono associate alla resistenza di

imatinib. Si sta quindi cercando di sviluppare molecole che siano in grado di bloccare BCR-ABL in altri siti

della tirosin chinasi mutata, come in siti allosterici, o nel sito di legame al substrato. Questa terapia è stata

ampliata anche in altri tipi di tumori, ma non si è ottenuta la stessa efficienza.

TK recettoriali

Esistono degli inibitori delle tk recettoriali, che entrano all’interno della cellula bloccando il sito catalitico. I

farmaci sono chiamati Gefitinib e Erlotinib. EGFR: è overespresso in molti tumori, ed in altri è attivato

costitutivamente, anche senza la necessità del ligando. Vengono usati in associazione con altri farmaci

antitumorali nei carcinomi polmonari e piccole cellule. Le cellule tumorali di questo tipo non dipendono solo

dalle mutazioni del TK recettoriali e per questo che l’efficienza non è elevata.

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Immunosoppressori

L’immunosoppressione descrive le misure usate per ridurre la risposta immune in particolare nella medicina

dei trapianti e per controllare le malattie autoimmuni. La maggior parte delle misure però non è antigene

specifica. Sia l’immunità innata che quella acquisita sono coinvolte nell’azione di rigetto dell’organo a seguito

di trapianto. Si assistono ad una serie di attivazione e proliferazione di cellule in presenza dell’organo

trapiantato. Si riconscono dei linfociti T di tipo helper, che si differenziano in linfociti T di tipo 1 che sono

linfociti attivi nella risposta immune, mentre i linfociti T di tipo 2 tengono sotto controllo la risposta

immunitaria. Th0 si attivano verso un Th1 e si assiste all’ipersensibilità di tipo ritardato, attivazione dei

macrofagi e anticorpi fissanti il complemento e innesco del processo di rigetto, mentre i Th2 tengono sotto

controllo il Th1 e portano alla tolleranza. Con tolleranza si indica l’assenza di risposta a molecole

riconosciute dal sistema immunitario. La possibilità di una molecola di indurre tolleranza è determinata dalla

modalità di presentazione al sistema immunitario. Il rigetto è una reazione immune che mostra memoria e

specificità. Per ridurre al minimo tale reazione viene eseguito il crossmatch: il tessuto del donatore viene

cimentato con quello del ricevente. La copia D/R viene mecciata per il gruppo ABO e per gli antigeni di classe

I e II (HLA). Al maggior numero di compatibilità corrisponde la maggior probabilità di non avere reazioni di

rigetto. La reazione di rigetto è indotta dalle cellule T helper del ricevente che riconoscono gli antigeni del

sistema MHC del donatore. I trapianti vengono effettuati da vivente o da cadavere. Il rigetto si divide in base

al tempo di comparsa: rigetto iperacuto: comare poche minuti o poche ore dopo il contatto con l’organo

trapiantato. È causato da anticorpi citotossici preformati diretti contro gli anticorpi di classe I e II del

donatore. Gli anticorpi legano gli anticorpi espressi sull’endotelio del donatore e causano l’attivazione del

complemento, l’aggregazione piastrinica e l’ostruzione microvascolare. Il rigetto acuto compare pochi

giorni/settimane dopo il trapianto. È causato da una precedente sensibilizzazione del ricevente verso gli

antigeni di istocompatibilità del donatore. È mediato da cellule T e il danno è diretto verso i tubuli (tubulite).

La gravità del rigetto è definita su una scala da lieve a grave e il trattamento dipende dalla gravità delle lesioni

istologiche. Il rigetto acuto tubulo-interstiziale, può ripetersi anche dopo un anno e questo rende il paziente

a rischio di sviluppo di rigetto cronico. Il rigetto cronico è tardivo, dopo il sesto mese. e causato dalla

sensibilizzazione del ricevente verso gli antigeni del trapianto. Può essere innescato dalla interruzione della

immunosoppressione.si verifica in pazienti con pregressi rigetti acuti ricorrenti, o rigetti acuti tardivi. È un

deterioramento lento e progressivo della funzione dell’organo caratterizzato da alterazioni istologiche che

interessano i capillari, i tubuli e l’interstizio. può essere considerato una reazione da ipersensibilità ritardata.

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I farmaci immunosoppressori presentano meccanismi d’azione diversi e

modulano eventi intracellulari diversi in modo da associare più farmaci

immunosoppressivi. La terapia immunosoppressiva è costituita da associazioni in

modo da tener basso l’azione dei singoli agenti ma di colpisce la cellula da più

punti di vista. I primi immuni soppressori sono degli anni ’60. Il primo trapianto

d’organo è stato fatto all’inizio degli anni ’60. Negli anni ’80 si ha avuto

un’inversione dei rigetti grazie allo sviluppo della ciclosporina. I farmaci

immunosoppressivi più potenti sono gli steroidi (ormoni lipofili che entrano in

cellula e si legano al loro recettore che solitamente è bloccato, che se legato allo

steroide dimerizza e trasloca nel nucleo e inizia la trascrizione genica di geni che

portano alla produzione di fattori anti-infiammatori e anti-immunosoppressivi,

come IL-10, IL-1. Oltre ad indurre la sintesi di questi fattori, si assiste anche alla

diminuzione della trascrizione di sostanze che hanno effetto immunostimolante.

È stato postulato che il legame del recettore dello steroide porti al reclutamento

amento sugli istoni la HDAc che deacetilando il DNA portando ad una chiusura

della cromatina che in questo modo trascrive di meno.

La ciclosporina è un composto naturale prodotto da un fungo. È una grossa

molecola lipofila. Il suo target è il linfocita T. senza la ciclosporina, la cellula presenta l’antigene e il recettore

si attiva promuovendo l’entrata del calcio all’interno del linfocita, il quale attiva una calcineurina (fosfatasi

calcio-dipendete) che defosforila NFAT che diventa attivo e migra nel nucleo promuovendo la trascrizione di

IL2. La ciclosporina entra nella cellula e si lega ad un recettore intracitoplasmatico ubiquitario, definito come

ciclofilina (recettore enzimatico ubiquitario citoplasmatico, modulatore dell’attività delle cellule T), che

blocca l’azione della calcineurina che non fosforila più NFACT che non procede più nel nucleo e non

promuove la trascrizione di IL-2, viene impedita la proliferazione e la differenziazione cellulare. Con questo

stesso meccanismo viene prevenuta l’amplificazione della reazione di rigetto. La ciclosporina presenta effetti

collaterali e per questo motivo non può essere somministrata per troppo tempo e a concentrazioni troppo

elevate. È stato costruito un farmaco di sintesi, definito Tacrolimus, che segue lo stesso percorso della

ciclosporina, ma a livello intracitoplasmatico si lega alla proteina che lega l’FK e blocca la calcineurina. Non

sono ridotti però gli effetti tossici. L’inibizione della sintesi di IL2 porta al blocco della proliferazione e

differenziamento, produzione di anticorpi, amplificazione della risposta immune.

Derivati dalla rapamicina: Sirolimus e everolimus funzionano a valle dell’attivazione dell’IL-2, la quale, se

non è bloccata, agisce sul suo recettore per le IL2 che è sulla cellula stessa. Il legame al recettore porta

all’attivazione di mTor che promuove la traduzione degli mRNA selezionati che promuovono la transizione

del ciclo cellulare dalla fase G1 alla fase S. sirolimus, a livello intercellulare si lega alla proteina che lega l’FK

e blocca l’azione di mTor, inibendo la traduzione e inducendo l’arresto delle cellule T nella fase G1. L’azione

sinergica di ciclosporina e sirolimus riesce a diminuire il signaling dell’IL2. Sirolimus non è un farmaco di facile

uso in quanto è bersaglio di molti citocromi e della proteina P. Sirolimus viene utilizzato anche per gli stent

medicati a seguito di ostruzioni coronariche, in modo che a livello locale si abbia l’immunosoppressione.

Antimetaboliti (= sostanza che assomiglia ad un importante metabolita dell’organismo)

immunosoppressori: azatioprina e micofenolato fofetil. L’aziotropina blocca la formazione di nucleotidi

intracellulari che bloccano la produzione del DNA e dell’RNA. Una volta introdotta nell’organismo viene

trasformata in 6-mercaptopiurina che è simile alla inosina 6-mp che è importante per la sintesi della guanina,

pertanto con l’aziotioprina si blocca la via de-novo dei nucleotidi. Il micofenolato mofetile viene trasformato

nel fegato ad acido micofenolico che diventa un inibitore non competitivo potente e reversibile dell’inosina

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monofosfato deidrogenasi, un enzima specifico dei linfociti, bloccando la sintesi de novo della guanosina

monofosfato. Le cellule in rapida proliferazione necessitano di componenti degli acidi nuclei.

Globuline anti-linfocitarie: fino a non molto tempo fa si procedeva con La deplezione dei linfociti T che

hanno un ruolo critico nello sviluppo della risposta immune. Si immunizzano dei conigli con I timociti umani

e si purificano le immunoglobuline che interagiscono con moltissimi recettori sulla superficie dei linfociti,

inattivando I T linfo. Le cellule vengono lisate dal complemento e non possono essere attivate dagli antigeni

perchè sono bloccate. A partire dagli anni ’70 sono state utilizzate le globuline anti-linfocitarie.

Anticorpi monoclonali: Uno dei primi monoclonali ad essere stato prodotto è stato un monoclonare murino

contro il complesso antigenico CD3, che è caratteristico di tuti i linfociti T, definito come Muromonab. Uno

degli ultimi anticorpi monoclonali è diretto contro il recettore per l’IL2 che è costituito da 3 catene: alfa

(CD25), beta (CD12) e gamma (CD132). Le catene beta e gamma sono presenti sui linfociti non attivati e

reagiscono a concentrazioni non elevate di IL2. Una piccola componente di IL2 attiva il linfocita, che risponde

esponendo la catena alfa del recettore. Pertanto, la catena alfa, CD25, è espressa solo dai linfociti T attivati.

Sono stati sviluppati il basiliximab e daclizumab che si legano al recettore CD25 della IL-2 sulle cellule T

attivate, quindi non causano una linfopenia generalizzata. Il futuro dell’immunosoppressione sta andando

alla ricerca di nuove strategie per cercare di indurre la tolleranza immunologica. Cercando di agire sulla co-

stimolazione si sta vedendo che se si blocca la fase di co-stimolazione non si ha più l’attivazione delle cellule

T. 22

22/03/2018

Amminoacidi eccitatori

La conoscenza di questi aa è molto ampia ma i farmaci che si possono usare per modulare questo sistema

sono molto pochi. Il glutammato è il principale nt eccitatorio del sistema nervoso centrale ed è prodotto nei

neuroni da una doppia via di sintesi: dal glucosio nel ciclo di Krebs e dalla glutammina sintetizzata nelle

cellule gliali. La sintesi è strettamente legata a quella del nt inibitorio GABA è quindi impossibile modulare la

sintesi del glutammato in positivo o in negato senza intervenire sul GABA. La quantità di glutammato

all’interno di un neurone deve essere garantita sempre per il corretto funzionamento del cervello. Accanto

alla sintesi del glutammato dentro al neurone, esiste anche un sistema alternativo: il glutammato che

proviene dal ciclo di Krebs viene immagazzinato in vescicole e viene rilasciato in modo calcio dipendente

esercitando la sua funzione. Successivamente viene ricaptato ad opera di trasportatori per EAAT che sono

presenti sul neurone e prelevano il glutammato e lo riportano al suo interno. EAAT è presente anche sulle

cellule gliali che sono in grado di ricaptare al loro interno il glutammato. Questo glutammato viene

immediatamente trasformato in glutammina ad opera della glutammina sintasi, che però non ha alcun ruolo

da nt. La glia è quindi un deposito di glutammina. Quando il neurone ha necessità di glutammato, mediante

il trasportatore della glutammina, passa la glutammina dall’astrocita al neurone, dove è presente un enzima,

la glutaminasi, che trasforma la glutammina in glutammato. Utilizzando degli analoghi sintetici si sono

sviluppati dei diversi tipi di recettori che sono comunque tutti in grado di legare glutammato.

I recettori del glutammato si dividono in due grandi famiglie: ionotropi (recettori canali) e metabotropi (a G

protin). I recettori ionotropici sono canali costituiti da un poro e da un punto dove si lega l’agonista e da un

domain etracellulare glicosilato. Ciascun recettore è costituito da 4-5 sub che si assemblano a formare il

recettore. I recettori ionotropi si dividono in 3 categoria: AMPA, NMDA, kainato. AMPA e Kainato fanno

passare sodio e potassio, mentre NMDA fa passare sia sodio, potassio e calcio. Ciascun recettore è costituito

da una serie di subunità che possono essere diverse a formare i recettori ionotropi. Sono particolarmente

complessi i recettori NMDA in quanto sono formati da un canale al quale si legano due molecole di

2+. 2+

glutammato e quando è al riposo è sempre bloccato da uno ione Mg Oltre ad avere il blocco del Mg , per

poter funzionare necessita di una glicina. Quindi è un recettore altamente permeabile al calcio ed è bloccato

dal Mg in modo voltaggio dipendente a concentrazioni fisiologiche di Mg, quando la cellula è normalmente

polarizzata e scompare con la depolarizzazione. L’attivazione dei recettori richiede oltre al glutammato

glicina: azione su 2 siti (gli antagonisti della glicina inibiscono l’azione del glutammato).

I recettori metabotropici si dividono in 3 gruppi: mGlu di tipo I e di tipo II che sono collegati ad una Gq che

attivano la fosfolipasi C e mGlu di tipo III che attivano una proteina Gi di tipo inibitorio e diminuiscono

l’attività dell’adenilato ciclasi. Sono recettori a 7 domini transmembrana e la cristallizzazione ha dimostrato

che il dominio extracellulare presenta un dominio bilobato come anche nei recettori ionotropici.

Ruolo dei recettori glutammatergici

AMPA e kainato mediano la trasmissione sinaptiche veloce del SNC: essenziale perché funzioni il cervello. Gli

NMDA coesistono sugli stessi neuroni di AMPA e sono coinvolti nella componente lenta del potenziale

postsinaptico eccitatorio. I metabotropici: sia pre che post sinaptici e sono soprattutto modulatori. I recettori

NMDA sono coinvolti in un fenomeno sinaptico importante, la Long term potentiation. LTP è un aumento

notevole e duraturo della trasmissione che si verifica a livello di varie sinapsi nel SNC in seguito ad una breve

(condizionante) stimolazione presinaptica ad alta frequenza. Il glutammato si lega all’NMDA e in parte anche

al metabotropo, l’AMPA rispode a concentrazioni anche molto più basse di glutammato, e il glutammato

legato all’NMDA non porta alla sua apertura in quanto vi è presente il magnesio. In queste condizioni si ha

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solo il funzionamento dell’AMPA che permette l’entrata del sodio e si ha una breve depolarizzazione ed

eccitazione con un potenziale sinaptico veloce. Se la depolarizzazione è molto forte perché il neurone

presinaptico è fortemente attivato e in tempo breve rilascia molto glutammato, la depolarizzazione del

neurone post-sinaptico è molto sostenuta. La cellula fortemente depolarizzata scalza il Mg2+ dall’NMDA, in

presenza di glutammato, entra il sodio e il calcio, che porta ad una forte attivazione di PKC altera

l’espressione genica causando delle modificazioni della parte post-sinaptica. Si ha un’alterazione e plasticità

di tutta la sinapsi con anche la formazione di nuove spine dendritiche che è alla base dei processi di memoria

e apprendimento. Il calcio è in grado di attivare anche il NO che viene sintetizzato dal NOS e funziona come

messaggero retrogrado stimolando la presinapsi incrementando il rilascio di glutammato.

Malattie neurodegenerative e NMDA: eccitotossicità

Nonostante il suo ruolo come nt il glutammato è tossico per i neuroni (sindrome del ristorante cinese).

L’iniezione localizzata di acido kainico viene utilizzata sperimentalmente per uccidere I neuroni: libera

glutammato che agisce su AMPA e NMDA. Il sovraccarico di calcio è la causa primaria di morte neuronale:

[Ca] intracellulare è 10-7M(0.1uM). [Ca] extracellulare nei fluidi biol è 2.4mM: mantenuta bassa nella cellula

da: controllo dell’ingresso di Ca, controllo dell’estrusione di Ca e scambio di Ca tra il citosol e i siti di accumulo

intracellulare. A seguito di ictus, le cellule in carenza di ossigeno, muoio e si assiste ad un rilascio massiccio

di glutammato che porta alla morte delle cellule vicine e così via. Si scatenano dei processi di morte cellulare

causati dal glutammato. Quando si ha un eccesso di glutammato AMPA si apre e si ha la depolarizzazione

sostenuta e si apre anche NMDA ed entra il calcio. Dopo un certo intervallo di tempo si attivano anche i

recettori metabotropici, che agiscono sulle fosfolipasi C le quali, agendo sulle IP3 promuovono un ulteriore

rilascio di calcio a livello intracellulare. Inoltre, essendo l’AMPA ancora attivato, continua ad entrare sodio e

vi sono delle pompe sodio-calcio che estrudo sodio e internalizzano calcio aumentando notevolmente la

concentrazione di calcio intracellulare. Esistono delle pompe di controllo che riescono ad estrudere il calcio,

ma se la depolarizzazione si protrae per più tempo, il calcio continua ad entrare e la cellula lo internalizza

negli organelli citoplasmatici e anche nel mitocondrio. In questo momento siamo nel punto di non ritorno in

quanto non si ha più produzione di ATP e il calcio inizia ad accumularsi all’interno delle cellule. Il calcio attiva

protein kinasi, proteasi, DNAsi, radicali liberi dell’ossigeno portando a danni alla membrana e al DNA

innescando la morte. Esistono dei meccanismi di difesa che utilizzano le pompe del calcio e i sistemi di

detossificazione scavenger dei radicali liberi.

Nell’isola di Terranova nel’1987 il 70-80% della popolazione si era ammalata di Alzheimer. Ciò era dovuto al

fato che si nutrivano di una cozza contaminata da un’alga, acido domolico, che è un analogo del glutammato.

Isola di GUAM: alto numero di soggetti con una sindrome caratterizzata da demenza: un aa eccitatorio

presente nei semi di una pianta cicade mangiata dagli indigeni o da altri animali. I pipistrelli erano un cibo

molto prelibato per gli indigeni. I pipistrelli accumulavano la biotossina. La pianta ora non viene più mangiata:

e la sindrome è scomparsa.

I farmaci che agiscono cercando di bloccare il recettore NMDA non riescono a funzionare e hanno poca

efficacia e molti effetti collaterali. Ancora non si hanno degli antagonisti che si possano usare in clinica. Si

devono cercare degli antagonisti specifici. L’AMPA non può essere bloccata in quanto si spegnerebbe il

cervello, sono stati sviluppati degli agonisti di AMPA per stimolare la memoria nei pazienti Alzheimer. Sono

stati sviluppati degli antagonisti degli mGlu. L’unico farmaco che agisce sull’NMDA è la ketamina che è un

farmaco molto potente e viene usato come anestetico.

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28/03/18

Neurotrasmettitori diversi Grazie alla presenza di un

recettore presinaptico si ha il

controllo del nt sterro. Su queste

vie di trasmissione classica si può

agire a molti livelli: sulla via di

sintesi, sulla ricaptazione

all’interno delle vescicole,

inibizione del metabolismo

oppure agendo a livello del

recettore. Difronte ad una via

neurotrasmettitoriale classica si

hanno molti punti di agganci per

i farmaci. Esistono dei neuroni

che come nt usano peptidi. La

maggior parte della farmacologia

si basa su molecole segnale

piccole e non peptidiche. Però

esiste un elevato numero di

mediatori peptidici (> di quelli

non peptidici) e se ne trovano

sempre di nuovi.

I neurotrasmettitori peptidi sono

costituiti da una catena lineare da 3 a 200 aa (ormoni). La molecola più piccola è il TRH. Questi peptidi sono

soggetti a modificazioni post-traduzionali (Glicosilazione, amidazione, fosforilazione etc. Spesso legami di

solfuro che li rendono ciclici). Si conosce poco della loro conformazione in soluzione, in quanto sono poco

Cristallizzabili (<40aa). Lo studio della conformazione permette di capire in che modo il peptide si lega al

recettore è pertanto difficile disegnare agonisti e antagonisti.

Esistono molti mediatori peptidergici che sono prodotti da cellule e agiscono su altre cellule. Sono nt e

mediatori neuronedocrini (=sostanze in grado di agire su ghiandole come LH). Esistono anche peptidi di

origine non neuronale come peptidi derivati dal plasma: angiotensina, dal pancreas: insulina; Fattori di

crescita: prodotti da molte cellule differenti che controllano la crescita ed il differenziamento cellulare e

mediatori del sistema immune: citochine. La struttura di un peptide è direttamente codificata nel genoma

(+ semplice dei neurotrasmettitori convenzionali). Viene prodotta dalla cellula una proteina precursore più

grande, che contiene la sequenza del peptide. Vengono prodotti gli enzimi per tagliare il precursore. Si ha

sempre la sintesi di un pre-pro-ormone (proteina) :100-250 aa con una sequenza segnale (signal peptide)

sull’ N terminale: è ricco di aa idrofobici ed è fondamentale per l’inserzione nel reticolo endoplasmatico. Una

volta entrato nel RE, si ha il distacco del segnale con la formazione del Pro-ormone. La cellula produce una

serie di proteasi che procedono con il taglio endoproteolitico che tagliano a livello di aa basici (Lys-Lys Lys-

Arg). Da un preormone possono derivare peptidi diversi tra loro o copie multiple dello stesso peptide. Dopo

il taglio I peptidi finali possono essere ulteriormente modificati (amidazione, solfatazione) prima del rilascio.

Le proteine sintetizzate dai ribosomi passano nel reticolo endoplasmico ruvido: da qui sono trasportati in

vescicole nel Golgi. Durante il trasporto nelle vescicole secretorie vengono trasformati in peptidi attivi.

25

Un’altra caratteristica di tutti i mediatori peptidici è che non si riconoscono fenomeni di ricaptazione e non

vengono riciclate in vescicole. I recettori ai quali si legano I peptidi sono recettori a proteine G o ad attività

Tirosin chinasica intrinseca: NON si conoscono recettori canale. Trasmissione non velocissima. I fattori di

crescita si legano ad attivatori della tirosin chinasica intrinseca. Ad oggi non si conoscono peptidi che legano

recettori canali.

Il gene con esoni e introni viene trascritto In toto per formare mRNA che viene poi tagliato e ricongiunto per

rimuovere gli introni e alcuni esoni, formando RNA, che viene tradotto. A secondo della cellula e dello stimolo

Può essere prodotto un peptide o un altro. Pertanto, a partire da uno stesso gene si possono avere peptidi

diversi. Come nel caso della calcitonina della tiroide che regola il metabolismo dell’osso. Nei neuroni lo

splicing alternativo porta alla produzione Calcitonin gene related peptide che modula infiammazione e

dolore. Questo peptide è molto studiato perché sembra essere associato all’emicrania.

Peptidi oppioidi

Peptidi che si legano ai recettori oppioidi a proteine G e sono gli stessi ai quali si legano la morfina e l’eroina.

Si hanno 3 precursori preproopiomelanocrtina, preporencefalina e preprodinorfina. Dai preproomoni si

originano diversi tipi di peptidi oppioidi. I peptidi sono sintetizzati come pre-proteine nel reticolo

endoplasmatico rugoso. La pre-proteina risultante attraversa l’apparato di Golgi e viene immagazzinata in

vescicole trasportate assonalmente. All’interno delle vescicole si completa la formazione del peptide:

scissione proteolitica, modificazione delle estremità del peptide, glicosilazione, fosforilazione, formazione

dei ponti disolfuro. I prptidi non sono buoni farmaci perché sono scarsamente assorbiti in seguito a

somministrazione orale, vengono degradati nello stomaco. Devono essere somministrati per via iniettiva,

Via intranasale. Hanno una breve durata d’azione perché sono rapidamente idrolizzati dalle peptidasi

plasmatiche e tissutali. La loro sintesi può essere costosa non passano la barriera ematoencefalica. Per poter

modulare l’attività di questi peptidi bisogna andare alla ricerca di analoghi o antagonisti non peptidici che

siano in grado di legare i recettori, ma per questo è fondamentale la conoscenza a livello strutturale.

Tra gli antagonisti si riconoscono gli antagonisti dei recettori dei peptidi oppioidi: naloxone e naltrexone e

antagonisti del recettore della angiotensina farmaci antipertensivi (come i sartani). Sono tutti NON peptidici.

Esistono dei casi in cui non si può fare a meno di somministrare peptidi come farmaci come nel caso

dell’insulina, che serve a tenere sotto controllo la glicemia. La prima insulina utilizzata dai pazienti diabetici

era insulina estratta dal pacnreas di mailae. Un caso analogo è stato quello dell’ormone della crescita che

veniva prelevato dall’ipofisi di cadavere. Questi però portano a scarso rendimenti, attivazione immunitaria

e trasmissione di malattia. Mediante le biotecnologie si sono potute sintetizzare le proteine mediante

ingegneria genetica. I generazione: copie dirette di ormoni umani sintetizzati tramite tasfezione del gene

umano in un sistema di espressione ( cellulle o batteri): proteina ricombinante. II generazione: proteine che

sono state ingenerizzate: alterando il gene prima della trasfezione o modificandolo il prodotto finale es:

insulina con azione più prolungata. Mediante aggiunta di PEG all’ormone della crescita ne prolunga l’emivita.

Si sta cercando di utilizzare divrsi tipi di vettori perpoter sviluppare determinate protine come nel caso del

virus del mosaico del tabacco o della lattuga. Sviluppo di animali transgenici come la mucca da latte in grado

di secernere proteine nel latte stesso. 26

NO

Scoperto negli anni ’80, è un gas ed è un importate mediatore. viene sintetizzato a partire dall’aa L-arginina

e O2 molecolare ad opera di una serie di enzimi le NO sintasi: si forma NO e citrullina. Esistono 3 isoforme di

NOS: 1 inducibile e 2 costitutive (dove la sintesi della NOS avviene sempre ma non implica che siano sempre

attive)

 eNOS= NOS endoteliale: cellule endoteliali, nella regolazione della pressione sanguigna

 nNOS= NOS neuronale dove regolano funzioni neuronali

 iNOS= NOS inducibile (nei macrofagi, cellule immuni, nell’endotelio in seguito a stimolazione,

fibroblasti)

Le NOS sono enzimi complessi che catalizzano reazioni di ossigenasi e reduttasi. Le NOS costitutive sono

attivate dalla Ca-calmodulina. Non esiste il recettore per l’NO andando direttamente sugli effettori, che è la

guanilatociclasi. NO attiva GC legandosi al gruppo eme dell’enzima, che è un’attivazione rapida. NO può

attivare la GC nelle stesse cellule che lo producono: effetto autocrino, ma può anche diffondere rapidamente

e attiva GC nelle cellule circostanti. CGMP attiva agisce sulla proteina chinasi G, sulle fosdodiesterasi dei

nucleotidi ciclici, su canali ionici e altre proteine. L’effetto finale dell’NO è la diminuzione degli effetti mediati

da Ca++, come la contrazione della musculatura liscia e l’aggregazione piastrinica. Inoltre, diminuisce

adesione e migrazione dei monociti, l’aggregazione piastrica e l’attivazione di fibroblasti: effetti

antiaterosclerotico. Livelli elevati di NO: può essere citotossico ed è un mediatore dell’infiammazione.

Due molecole di NO assieme all’ossigeno portano alla formazione di nitriti e nitrati che fusi all’emoglobina

portano all’eliminazione di NO. Non è facile studiare l’attività dell’NO nelle cellule, pertanto per capire

l’attivazione del sistema si analizzano i prodotti di scarto, ossia i nitriti. Nell’endotelio si ha un’attività

costitutiva di NO che permette ai vasi di essere sempre dilatati nell’organismo. È una via tonicamente attiva.

La NOS ha effetti sinaptici nel sistema nervoso centrale e periferico complessi: nel SNC è coinvolto nello

sviluppo neuronale, nella plasticità sinaptica e nella trasmissione del dolore. Nel SNP è rilasciato da nervi nei

bronchi, nel tratto gastrointestinale e nel controllo dell’erezione del pene. Nel sistema immunitario,

l’azione della NOS inducibile è importante per l’azione fagocitaria del sistema dell’immunità innata, in modo

da distruggere le sostanze fagocitate. Una delle funzioni più studiate e modulate con i farmaci è il ruolo

dell’NO nel controllo della pressione sanguigna, in quanto è un potente vasodilatatore. Quando entra calcio,

la NOS endoteliale porta alla formazione dell’NO e citrullina. NO diffonde sulla cellula muscolare liscia e

attiva la guanilato cilclasi con formazione di cGMP che porta alla vasodilatazione. Quando si ha un segnale

che porta alla produzione di NO mediante lo stress da stiramento. Esistono delle fosfodiesterasi specifiche

che pongono fine al ciclo delle cGMP.

Esistono dei farmaci che modulano l’NO:

 Donatori di ossido nitrico: nitroglicerina come dilatatore delle coronarie e nitroprussiato, che

forniscono direttamente NO. La nitroglicerina veniva utilizzata per l’angina pectoris. L nitroprussiato

è un potente vasodilatatore e non viene utilizzato cronicamente.

 Potenziatori dell’effetto di Ossido nitrico: dieta ricca di L-arginina

 Inibitori della fosfodiesterasi di tipo V (distruggono il cGMP): sildenafil (viagra): prolunga l’effetto del

NO rilasciato dai nervi nel pene e prolunga l’erezione

Inibizione della NO è molto pericolosa perché si hanno problemi di vasocostrizione. Sono antagonisti della

NO N monometil L-arginina (LNMMA) e la N-nitro-L-arginina-metil estere (L-NAME) e sono usati

27

sperimentalmente per determinare l’eventuale coinvolgimento di NO. L’ideale sarebbe trovare degli inibitori

delle iNOS, che si iperattivano nelle infiammazioni. 28

04/04/18

I recettori a proteine G

La famiglia dei recettori a proteine G rappresenta il piu’ largo e versatile gruppo di recettori di membrana. Il

progetto genoma ha scoperto 800 geni per GPCR: I farmaci in uso che hanno come bersaglio I GPCR (che

costituiscono il 30% di tutti I farmaci) interagiscono al massimo con 30 di questi recettori. Ci sono ancora

molti recettori a proteine G che non moduliamo farmacologicamente e potrebbero rappresentare un

importante bersaglio per nuovi farmaci. A tutt’oggi ci sono più di 150 recettori orfani (orphan receptors),

ossia recettori per i quali non si riconosce il ligando. Sono recettori a 7 domini transmembrana, per i quali

non sono conosciuti ligandi né endogeni né esogeni. come nel caso dei recettori che legavano i derivati della

cannabis. Le proteine G trasferiscono Il segnale dai recettori agli effettori attraverso un ciclo regolato dal

GTP 1 unica catena proteica che attraversa la membrana 7 volte. Uno dei loop intracellulari è piu’ lungo ed

interagisce con le proteine G ed è siti di fosforilazione.

Quando un ligando lega il suo recettore a proteine G, la sub alfa della proteina G sposta il GDP per legare il

GTP che permette di staccare la sub alfa dalla beta-gamma e alfa-GTP interagisce con i suoi effettori ed

attivare la funzione cellulare. L’azione finisce perché alfa possiede attività GTPasica intrinseca e una volta

legata all’effettore idrolizza GTP in GDP: riassociazione con beta-gamma.

Le catene a differiscono: as stimola adenilato ciclasi, inibisce canali K, ai inibisce adenilato ciclasi , attiva

canali K e aq modula la fosfolipasi C. si hanno delle Galfa di tipo eccitatorio e Gi di tipo inibitori. Anche le sub

beta e gamma hanno capacità di modulare funzioni all’interno della cellula. Lo stessa enzima bersaglio può

essere stimolato da un recettore o inibito da un recettore a seconda che il recettore sia accoppiato a proteine

alfa inibitorie o eccitatorie.

Tra gli effettosi principali si hanno l’adenilato cilasi, canali e fosofilpais C. Adenilato ciclasi è un enzima che

converte ATP in cAMP (AMP ciclico). cAMP è un secondo messaggero che diffonde nella cellula e regola

l’attività di un gruppo di protein chinasi protein kinasi A (PKA). Le PKA fosforilano un numero limitato di

substrati, influendo sulla funzione cellulare: effetto biologico. Le fosfodiestarasi trasformano l’AMPc in 5-

AMP, distruggendo il secondo messaggero. La caffeina blocca le fosfodiestarasi contribuendo ad un aumento

dell’eccitazione nella cellula.

La cascata degli inisitoli parte dalla fosfatidilinositolo di membrana che è formato da uno zucchero (inositolo)

e da un gruppo fosfadilico. Quando si ha l’attivazione della fosfolipasi C questa spezza il PIP3 in PIP3 e DAG

promuovenfo il rilascio di calcio dagli store intracellulari.

Recettori degli oppioidi

Recettori a proteine G che lega ligandi endogeni di tipo peptidico e anche derivati dal papavero da oppio

(morfina, codeina e tebaina) farmaci che vengono usati per togliere dolore. L’effetto dei peptidi oppioidi

(endorfine ed encefalina) sono chiamati sistema di analgesia endogena o sistema endogeno di benessere, i

quanto l’organismo utilizza per togliere dolore e lo stress, quando si ha un’attivazione eccessiva delle cellule.

Una volta che l’oppioide si lega al recettore, vengono messi in atto all’interno della cellula dei meccanismi

sinergici che diminuiscono l’attivazione cellulare. Si attiva un sito delle proteine G inibitorie che portano alla

diminuzione dell’AMPc e del calcio, causando una diminuzione dell’attività cellulare e del rilascio di nt.

Sempre attraverso il sistema delle proteine G inibitorie si assiste anche alla modulazione di canali, che sono

direttamente regolati dall’attivazione di una proteina G inibitoria. A seguito del legame dell’oppiaceo al suo

recettore, si assiste all’apertura dei canali del potassio che porta all’iperpolarizzazione della cellula, dove la

cellula è restia a rispondere ad altri stimoli. Sempre attraverso all’attività della Gi si assiste alla chiusura di

29

canali di calcio, che non può più entrare. Tutti questi meccanismi contribuiscono all’inibizione della

trasmissione degli stimoli nocicettivi in varie vie neuronali:

 L’inibizione della adenilato ciclasi diminuisce il livello di AMP ciclico e quindi dell’attivazione cellulare

 L’attivazione dei canali K induce iperpolarizzazione (K esce dalla cellula)

 La soppressione di correnti di Ca++, canali di tipo L postsinaptici, e di tipo N presinaptici inibisce il

rilascio di neurotrasmettitori.

Regolazione dei recettori

Tutti I GPCR esibiscono una attività dipendente dal contesto: cioè la sensibilità del recettore cambia a

seconda della quantità di signaling che un determinato recettore ha stimolato in una determinata cellula: in

generale i recettori aggiustano la loro sensibilità sul range di concentrazioni di agonista alle quale sono

esposti fisiologicamente. Se modifichiamo la quantità di ligando fisiologica, il recettore cambia la sua

modalità di agire. I recettori desensitizzano in presenza di una esposizione prolungata o ripetuta ad un’alta

concentrazione di agonista e risensitizzano quando non sono esposti per un certo tempo all’agonista. Le

concentrazioni di un agonista vengono variate quando si somministrano antidolorifici come la morfina. Un

meccanismo importante per regolare la responsività di un recettore è la G protein–coupled receptor kinase

(GRK)-arrestin pathway. Così come le proteine G riconoscono I recettori attivati così GRK riconosce un

recettore a proteine G attivato, il che porta all’attivazione catalitica della protein chinasi che causa la

fosforilazione del recettore in siti specifici nel loop intracellulare del terminale carbossilico. Una volta

fosforilato il recettore viene riconosciuto e diventa substrato di proteine chiamate arrestine, che

impediscono al recettore di attivare altre proteine G. La fosforilazione ad opera della GRK e il binding

dell’arrestina risultano nella fine del signalling a proteina G, nonostante la presenza dell’agonista attivatore.

Un recettore presente sulla membrana e fosforilato dalle GRK non è in grado di segnalare in modo adeguato

e se legato alle arrestina risulta completamente inattivo. La via GRK-Arrestina facilita la internalizzazione del

recettore dalla superficie cellulare attraverso I clathrin-coated pits. Il recettore internalizzato può andare in

vescicole litiche e viene distrutto, altrimenti può essere liberato dall’arrestina e dalla fosforilazione per poi

essere riciclato sulla superficie cellulare in forma attiva. L’efficienza di questo sistema non è uguale per tutti

gli agonisti che legano lo stesso recettore. Si è visto che alcuni farmaci legano il recettore, portano alla

desensitizzazione e il recettore viene internalizzato più lentamente e rimane per più tempo inattivo sulla

cellulare. Per altri farmaci, si ha un’efficacia di internalizzazione molto rapida. Pertanto, il primo farmaco

porterà a più tolleranza rispetto al secondo farmaco. Farmaci che internalizzano di più danno meno

tolleranza rispetto ai farmaci che internalizzano di meno. Si ipotizza che vi sia in gioco una questione di

conformazione che assume il recettore in seguito al legame a determinati ligandi.

Prelevando topi in cui si sono modificati i recettori per gli oppioidi, in modo da indurre la capacità della

morfina a portare ad una maggiore internalizzazione. In questo topo si aveva un’azione di internalizzazione

maggior del recettore quando si somministrava morfina, rispetto al topo wt. Andando a vedere l’effetto

analgesico, si nota che si ha un effetto analgesico che diminuisce nel wt, mentre nel caso del topo KI si ha

una maggiore costante dell’effetto analgesico. Questi meccanismi hanno permesso di capire come mai il

metadone venga usato per il trattamento di eroinomani.

I recettori a proteine G per funzionare non ha bisogno di dimerizzare, ma si è scoperto che se sulla superficie

della cellula vi è un notevole quantitativo di proteine G, queste tendono ad organizzarsi in dimeri, che

possono essere costituiti da due recettori uguali, ma anche da due recettori diversi, come un recettore delta

con un recettore mu. Una volta che si stimolano questi recettori, si hanno dei segnali che sono diversi dal

segnale del singolo recettore. Questa scoperta è stata ottenuta mediante la FRET, che utilizza molecole

fluorescenti a diversa lunghezza d’onda, dove se le due molecole fluorescenti sono molto vicine tra di loro si

30

assiste alla fluorescenza di entrambe. Prelevando due recettori a proteine G e tramite ingegneria genetica si

sono creati dei recettori legati a due molecole fluorescenti che vengono trasfettate sulla stessa cellula e

fornendo la luce per attivare la luce blu, se i due recettori sono singoli si vedrà solo luce blu, ma se nel tempo

questi recettori si avvicinano tantissimo si vedranno la luce blu e la luce verde. Separando e selezionando

questi recettori dimerizzati, questi non sono si avvicinano l’uno all’altro ma si legano che sono stabilizzati da

ponti disolfuro e da code intracellulari che si legano tra di loro e da subunità che si traslocano. Si sta cercando

di capire se può essere utile legarli contemporaneamente, fornendo i due agonisti simili. Si è cominciata una

ricerca di drug-desing, dove si sono prelevati l’ossicodone e il naltridole collegati da una ragione linker che

sia in grado di attivare il dimero.

Somministrando contemporaneamente morfina e metadone sul dimero, si potrebbe avere

l’internalizzazione anche del recettore che normalmente non sarebbe internalizzato, in modo da diminuire

la tolleranza. In esperimenti condotti su topi, fornendo solo morfina si ha tolleranza, ma somministrando

anche metadone si ha una riduzione della tolleranza.

La modulazione allosterica è molto conosciuta per i recettori canali ed è data dalla presenza di un sito

principale e da siti allosterici che modulano l’attività del sito principale. Tra le regolazioni allosteriche più di

successo in farmacologia vi è il canale del Cl- GABA, che quando il GABA arriva il canale si apre e permette

l’entrata del cloro e si riconsocno una serie di siti allosterici come per le benzodiazepine e i barbiturici, dove

le benzodiazepine aumentano la frequenza di apertura del canale. Fino a non molto tempo fa non si avevano

farmaci in grado di modificare in modo allosterico delle GPRC, ma dalla struttura del recettore questa indica

che vi siano dei possibili siti allosterici, alcuni esterni in modo da aumentare il legame al sito ortosterico, altri

localizzati nella parte intracellulare diretto sulle proteine G. lo sviluppo di farmaci allosterici sono molto

sicuri, in quanto aumentano l’attività dell’agonista principale e vi è un limite, in quanto quando tutti i siti

allosterici sono occupati non si ha un eccesso di stimolazione.

Recettori a proteine G ad attività costitutiva:

Cioè un recettore può essere attivo anche in assenza dell’agonista: per alcuni recettori esiste una attivazione

di base del signalling intracellulare da parte di alcuni recettori a proteine G. Questo avviene in certi casi con

il recettore WT, spesso in seguito a mutazioni geniche attivanti. Molti geni per recettori presentano SNPs.

 AGONISTI INVERSI: ossia un farmaco che si lega ad un recettore costitutivamente attivato e fornisce

un effetto opposto all’agonista. Anche un agonista inverso può essere pieno o parziale

 ANTAGONISTI NEUTRI:

Agonismo inverso è la proprietà di un ligando di produrre una diminuzione nel livello basale di signalling

dopo essersi legato al recettore stesso. Questo effetto NON deve dipendere dallo spiazzamento dell’agonista

endogeno. Vi sono dei casi in cui i recettori costitutivi sono cause di malattie.

In genere però l’entità dell’attività costitutiva è a livello basso, e decisamente surclassata dalla attività

indotta dall’agonista. Per evidenziare bene l’attività costitutiva e per capire se una sostanza è un antagonista

neutro o un agonista inverso si usano sistemi in vitro in cui i recettori sono iperespressi, o mutati o con

l’aggiunta di molte proteine G per far diventare misurabili I livelli di attività costitutiva. Agonisti inversi utili

in caso di patologie caratterizzate da recettori con mutazioni che ne inducono l’attività costitutiva: sindrome

dell’adolescenza precoce, per la mutazione del recettore per LH nel testicolo, in presenza di ligando (LH)

normale. 31

05/04/18

I cannabinoidi

Mariuana è stata usata in medicina per millenni, ma fino al 1964 non si conosceva il suo principale

componente psicoattivo , il delta 9 THC, che è stato isolato da Gaoni e Mechoulam in forma pura e ne è stata

delucidata la sua struttura. THC esercita una grande varietà di effetti biologici perché mima delle sostanze

endogene, gli endocannabiboidi, anandamide e 2arachidonoilglicerolo, scoperti sempre dal gruppo di

Mechoulam nel 1992 e nel 1995; grande è stata difficoltà di identificazione e di isolamento di AEA, data la

sua natura lipofila; questi endocannabinoidi attivano specifici recettori : CB1 che vengono clonati da

Matsuda nel 1990, particolarmente abbondanti nel sistema nervoso centrale e periferico (alta densità

nell’ippocampo, nei gangli della base, nel cervelletto e nella corteccia cerebrale CB2, clonati successivamente

da Munro nel 1993 e principalmente espressi nel sistema immunitario. AEA similmente ad altri mediatori

lipidici è una molecola promiscua ed interagisce con diversi tipi di recettori, tra cui il recettore canale TRPV1

che è ormai considerato parte del sisteme endocannabinoide.Emergenti evidenze supportano il ruolo del

sistema endocannabinoide in una grande varietà di processi fisiologici e patofisiologici. Al presente è difficile

stabilire quali siano le funzioni in cui endocannabinoidi e recettori non siano coinvolti. Conseguentemente

la cannabis e i suoi derivati promettono una quasi infinita possibilità di terapia farmacologica e una grande

potenzialità terapeutica. Il cannabinolo è il primo cannabinoide ad essere isolato e delucidato nella sua

struttura, anche se non è il costituente più interessante dal punto di vista farmacologico ed è principalmente

un prodotto di ossidazione di altri cannabinoidi; è stato successivamente isolato anche il cannabidiolo che

terapeuticamnte è il componente più interessante. Dopo l’identificazione degli ENDO le tappe successive

della ricerca si sono indirizzate alla comprensione di come le concentrazioni tessutali fossero regolate in

condizioni fisiologiche e patologiche, cioè si sono studiati gli enzimi e le proteine che regolano tali

concentrazioni. Gli endo diffondono attraverso le membrane plasmatiche in dipendenza dal gradiente di

concentrazione intra-extracellulare attraverso un trasportatore di membrana o una proteina di legame

(EMT) che non è stata ancora caratterizzata.

Ha una lunga storia: 5000 anni, che inizia nell’Asia centrale e del Nordest, con un uso corrente in grande

espansione come sostanza ricreazionale o come farmaco. Fu introdotta nel NORD AMERICA dagli

immigranti nel XIX secolo, diventa un problema sociale nel XX secolo, fu legalmente bandita durante gli

anni 30.

La cannabis è il derivato crudo derivante dalla pianta Cannabis sativa L. che appartiene alla famiglia delle

CANNABACEE, che ha solo un genere con una specie, e che cresce nelle regioni tropicali e temperate.

Mariuana è il nome dato alle foglie e alle cime floreali secche della pianta femminile, preparate come una

mistura da fumo, l’hashish è la resina estratta.

La cannabis è molto complessa dal punto di vista chimico poiché contiene un larghissimo numero di

costituenti, che possono interagire tra loro. La pianta sintetizza più di 600 composti, di cui 70 sono

cannabinoidi (THC, cannabinolo, cannabidiolo ed isomeri del THC), terpeni ciclici. La presenza di tutti questi

composti possono dare diversi effetti che possono essere assenti se presi singolarmente. I cannabici più

importanti sono il THC, cannabinolo e cannabidiolo. La marijuana a scopo medicinale presenta il principio

attivo in concentrazioni minori. Il responsabile degli effetti psicoattivi è il delta-9-tetraidrocannabinolo,

alcuni effetti li riproduce anche il delta-8-THC, che è presente in piccolissima quantità nella marjuana. Gli

altri non hanno effetti psicoattivi ma possono interagire con THC aumentandone o diminuendone la potenza.

32

Meccanismo d’azione

Inizialmente si pensava ad un meccanismo basato su lipofilia, capacità di dissolversi nelle membrane e di

alterarne le funzioni. Facendo uno screening di recettori orfani, cioè clonati e senza ligando si sono trovati I

recettori per I cannabinoidi: CB1 e CB2. Sono dei recettori accoppiati a proteine G di tipo inibitorio e la loro

sequenza è molto simile, anche se CB1 è più lungo. La localizzazione di questi due recettori è diversa. Il

recettore CB1 si trova soprattuto nel sistema nervoso ed è quello che media molti degli effetti. Il CB2 si trova

nelle cellule immunitarie (anche nel cervello) e in tessuti periferici (adipociti). All’interno del cervello sono

presenti ad alta intensità nel cervelletto (coordinazione motoria), nell’ippocampo (memoria, dove la

somministrazione continuata di THC porta ad una LTP che alla lunga causa una diminuzione della capacità di

memorizzare e apprendere), zone della sostanza nigra e del globo pallido. È presente a basse intensità nel

tronco cerebrale (dove sono localizzati i centri regolatori della funzione cardiaca e respiratoria, sui quali i

cannabinoidi hanno effetti modesti), a differenza degli oppioidi che portano a depressione respiratoria o

come anche la cocaina, che stimolando il sistema noradrenergico porta a delle crisi ipertensive sul cuore.

Quindi assumendo THC non si muore per crisi cardiaca o respiratoria, ma comunque porta a gravi effetti

collaterali.

CB1 è un recettore inibitorie e ha un meccanismo simile a quello del recettore per gli oppioidi. Quando un

cannabinoide si lega al suo recettore, attiva una Gi inibitoria che diminuisce l’attività dell’adenilato ciclasi

con una diminuita formazione dell’AMPc e potenzia i canali rettificanti del potassio che esce e blocca i canali

del calcio. Il recettore cannabinoide presenta anche un’attività sulle MAPK modificando anche l’espressione

genica. La ricerca per i cannabici endogeni a portato alla scoperta di una serie di sostanze che sono in grado

di legare CB1 e CB2 che sono endogeni, come l’anandamide EAE e il 2-arachinoilglicerolo 2AG. Sono degli

endocannabinoidi prodotti on-demand, ossia non si ha un deposito di questi e vengono prodotti solo quando

richiesti. Una volta prodotti vengono rapidamente distrutti quando non è più richiesta la loro funzione. Sono

dei mediatori lipidici e quindi estremamente lipofili. Vengono prodotti a partire dalla membrana cellulare: la

sistesi del 2AG parte dal Pi sul quale agisce la PLC portantdo alla formazione del DAG e mediante l’azione la

DAG lipasi portano alla formazione del 2AG. EAE parte dalla formazione del acido arachidonico mediante

l’azione del NATa cui segue l’azione del NAPE. Gli enzimi deputati alla degradazione dell’EAE è la FAAH, che

potrebbe essere un efficace target per i farmaci incrementando l’azione dell’endocannabinoide. Invece,

l’enzima deputato alla degradazione del 2AG è il MAGL. L’anandamide può anche essere ricaptata, mediante

l’azione dell’ANT. Il sistema degli endocannabinoidi è di stress recovery, dove normalmente il sistema è

silente e viene attivato quando si ha la necessità di stress recovery. Il condizione di relax si ha il rilassamento

del tono muscolare, riduzione del dolore e dell’ansietà, diminuzione della temperatura corporea e della

pressione arterioasa. Segue una fase di rest, con una riduzione del controllo motorio, si procede con una

fase di forget, con estinzione di ricordi avversi e protect a livello cellulare ed emozionale e infine tutti gli

endocannabinoidi aumentano l’appetito in quanto l’organismo deve re-introdurre cibo per compensare la

situazione stressante.

A livello cellulare, gli endocannabinoidi non vengono prodotti dal neurone presinaptico, ma vengono

sintetizzati dal neurone post sinaptico e trovano il recettore sul neurone presinaptico, dando luogo ad un

sistema di controllo retrogrado. Quando il neurone presinaptico è particolarmente attivato, porta

all’attivazione dei sistemi endogeni del neurone post sinaptico mediante la formazione degli endogeni che

vengono rilasciati sulla memebrana presinaptica del neurone diminuendo l’attività neuronale. L’aumento di

calcio intracellulare, dovuto a depolarizzazione neuronale o stimolazione di recettori metabotropici

accoppiati a proteine Gq, attivano sia la formazione che il rilascio di endocannabinoidi neuronali postsinaptici

per attivare recettori presinaptici dei cannabinoidi., che hanno un’azione di inibizione sul release dei

neurotrasmettitori. Questi sistemi vengono attivati anche si ha troppa attività dei neuroni inibitori, pertanto

33

gli endocannabinoidi ristabiliscono l’omeostasi. Quando dall’esterno viene somministrato una sostanza che

attiva questi sistemi inibitori, in assenza di una precedente stimolazione, si potenzia lo stress recovery

ottenendo degli effetti estremi.

Effetti gratificanti delle sostanze d’abuso

Le più importanti sostanze d’abuso come i narcotici analgesici, gli psicostimolanti, la nicotina, l’alcool ed i

barbiturici, hanno in comune la proprietà di aumentare la concentrazione extracellulare di dopamina in

determinate aree cerebrali, in particolare nel nucleo accumbens, un’area del sistema mesolimbico. Il sistema

mesolimbico ha origine nell’area ventrale tegmentale (mesencefalo e termina nel nucleo accumbens,

nell’amigdala e nell’ippocampo. Esso ha un ruolo importante nel comportamento motivato naturale.

Lo spinello come tale non può essere un mezzo terapeutico in quanto non si sa quanto principio attivo ci sia

dentro e pertanto bisogna portare la messa a punto di forme farmaceutiche a dosaggio controllato per

somministazioni locali, si stanno cercando di produrre derivati cannabici privi di attività psicotropa oppure

si sta cercando di manipolare il tono endogeno.

Modulazione farmacologia del sistema cannabico:

- Sviluppo degli antagonisti sintetici per i recettori CB1 e/o CB2

- Antagonisti per il recettore CB non specifici

- Agonisti inversi

- Agonisti indiretti come i bloccanti della ricaptazione o gli inibitori della FAAH.

Vengono usati per il trattamento della nausea durante la chemioterapia e per stimolare l’appetito nei

pazienti con sindrome da deperimento di AIDS-correlata. Le altre patologie per le quali vi sono delle evidenze

preliminari tali da giustificare sperimentazioni cliniche controllate nell’uomo sono per la terapia del dolore,

sclerosi multipla dove il THC riesce a limitare la spasticità muscolare. Si stanno valutando i suoi effetti

neuroprotettivi e antiossidanti, Gilles de la tourette, epilessia, glaucoma.

Rimonabant è un antagonista recettoriale del CB1. Si è pensato di bloccare questo recettore nell’obesità in

modo che diminuissero l’appetito e la ricerca del cibo. In esperimenti condotti sui topi si è visto che quelli

trattati col farmaco diminuivano notevolmente di peso. Successivamente, questo farmaco è stato usato

anche in persone che non erano “grandi-obesi” e nel 2008 vi è stata una sospensione del farmaco in tutta

Europa e anche in Italia, in quanto nei pazienti in cui veniva dato il farmaco si aveva un aumento della

depressione e dell’attività suicida. Questo si verificava perché toglieva tutti i nt implicati nel piacere. Ad oggi

è stato re-introdotto in commercio ma i pazienti che ne fanno uso sono sempre sotto continuo controllo da

un punto di vista psichiatrico. 34

12/04/18

Stress

Fino al 1930 il termine stress non aveva a che fare con la salute, ma indicava la resistenza che un metallo ha

quando viene sottoposto ad una forza. Grazie ad Hans Selye si ebbe una nuova definizione di stress che è

risposta aspecifica dell’organismo ad ogni richiesta effettuata su di esso relazione tra uno stimolo esterno

pericoloso o minaccioso (stressor) e la reazione biologica interna dell’organismo (risposta di stress),

mantenimento dell’omeostasi la risposta di stress è caratterizzata dall’attivazione dell’asse ipotalamo-

ipofisi-surrene. Successivamente altri scienziati hanno lavorato sullo stress, come J. Mason che incominciò

a intravedere come la risposta di stress avviene quando lo stressor induce una risposta emozionale (sistema

limbico-ipotalamico), che attiva gli assi neuroendocrini: risposta multiormonale. Infine, si attribuisce allo

stress l’importanza degli aspetti psicologici, dove gli individui hanno risposte diverse ad uno stesso stimolo.

Esistono altre situazioni in cui si hanno risposte più individuali e soggettive a seconda di diverse situazioni.

Una volta che un determinato effetto esterno ha superato i filtri e arriva al nostro organismo come uno

stressor, attiva una risposta biologica che è uguale per tutti gli individui e per tutti i tipi di stress. Si parla di

una reazione interna dell’organismo che è generalizzata a tutti i tipi di stress.

Con stress si intende sia ciò che causa lo stressor sia la risposta allo stressor. Si ha una risposta biologica

centrale, dove il cervello mobilita i nt e porta l’organismo alla preparazione allo stress, mediante una risposta

adattativa generalizzata (GAS). Questa risposta porta a:

- Risposta biologica periferica che ha come fine ultimo la ridistribuzione dell’energia (modificazioni

neurodegenerative, neuroendocrine, muscolari e metaboliche)

- Risposta adattativa comportamentale: si ha un’attivazione o soppressione di particolare vie

neuronali, in modo da aumentare l’allerta, diminuzione del tempo di riflesso, inibizione di funzioni

fondamentali per la vita (assunzione di cibo e comportamento sessuale). Il fino ultimo è l’attivazione

della risposta Fight or flight.

I sistemi neurotrasmettitoriali fondamentali dell’attivazione dello stress sono:

- Asse ipotalamo-ipofisi-surrene

- Sistema noradrenergico locus ceruleus (SN simpatico)

Quando si ha un segnale di stress si attivano 2 vie:

- Via presente nell’ipotalamo dove si ha la produzione di CRH, che è un ormone che dall’ipotalamo va

all’ipofisi e porta alla produzione di un ormone circolante, ACTH, la quale entra in circolo e agisce

sulla corticale del surrene e induce la produzione dei glucorticoidi (nel mammifero è il cortisolo).

- Il locus ceruleus porta alla produzione di catecolamine (noradrenalina e adrenalina).

Si hanno dei controlli reciproci tra questi sistemi: il sistema del CRH agisce con un feedback positivo sul

sistema della noradrenalina e lo stesso sistema della noradrenalina agisce in modo positivo sul sistema della

CRH. Affinché una risposta allo stress sia efficiente e finalizzata a riportare l’organismo in omeostasi si deve

concludere il processo di stress che è data dall’attivazione di meccanismi di inattivazione. Il cortisolo ha la

capacità di inibire l’ipofisi che produce l’ACTH, dove l’ACTH è in grado di portare all’inibizione dell’ipotalamo.

Si hanno quindi dei meccanismi di feedback negativo. La noradrenalina inoltre, porta all’inattivazione della

produzione dei neurotrasmettitori prodotti dal locus ceruleus.

L’assenza di stress è incompatibile con la vita. È la sua mancata inattivazione che correla con diverse

patologie. 35

Durante lo stress si ha l’attivazione di nt che inducono ad un aumento della gluconeogenesi, ma si ha la

diminuzione delle funzioni riproduttive in quanto i glucocorticoidi porta all’inibizione della produzione degli

ormoni sessuali (testosterone ed estrogeni), agendo sull’GnRH. La mancata inattivazione dello stress può

portare all’inibizione cronica del sistema sessuale (monorrea frequente in bambine che fanno danza classica

per molto tempo).

Durante la risposta allo stress si ha un’inibizione degli ormoni deputati all’accrescimento, in quanto la CRH

inibisce il GH, in modo da garantire una corretta ridistribuzione dell’energia. Esisteva una condizione,

naninismo psicosociale, dove si aveva un mancato accrescimento dovuto ad uno stress cronico del bambino,

visto soprattuto in Romania.

Durante la risposta allo stress si hanno anche modificazioni di tipo immunitario. Grazie ad una serie di studi,

si è visto che sulle cellule del sistema immunitario esistono dei recettori per ormoni e neuropeptidi che sono

prodotti dal cervello-ipofisi-surrene durante la risposta allo stress. Le cellule del sistema immunitario sono

quindi in grado di sentire segnali che arrivano dal cervello e dagli ormoni. Il cortisolo, le catecolamine, la

metenchefalina hanno un effetto negativo sulla regolazione immune. Esistono anche recettori per gli ormoni

della crescita e il TSH con effetto positivo. I glucocorticoidi sono fortemente aumentati durante lo stress,

come anche le catecolamine e il segnale negativo viene potenziato. Ma un importante fattore

dell’attivazione del sistema immunitario è l’ormone della crescita, che però è inibito dai modulatori dello

stress, si ha quindi una diminuzione delle risposte immuni.

Il blocco dell’effetto delle catecolammine nel ratto, rende possibile la visualizzazione dell’effetto

imunosoppressore che viene migliorato. Somministrando un’antagonista dei glucorticoidi si nota che si ha

un parziale recupero della risposta allo stress. È importante distinguere tra la presenza di alterazioni

transitorie della risposta immunitaria ed una reale facilitazione all’ insorgenza di una patologia (infezioni,

cicatrizzazione di ferite, disseminazione metastatica). Un soggetto normale in buona salute può tollerare le

alterazioni di alcune funzioni immunitarie senza arrivare ad uno stato patologico.

- la vulnerabilità individuale: se si è già un soggetto particolarmente a rischio (anziani, soggetti

sottoposti a stress chirurgico) si può avere una maggior incidenza di ammalarsi

- fattori di rischio: si ha già il sistema immunitario basso ed esposti ad agente patogeno ci si può

ammalare di più.

Uno stato di immunosoppressione già preesistente:

- invecchiamento

- stress chirurgico

- esposizione ad un agente patogeno in un momento critico

Nell’animale da esperimento ci sono vari modelli di stress dove alcuni sono di tipo fisico (stimoli termici,

stimoli elettrici, chirurgia), altri sono stress psicologici (contenzione (restraint), esposizione ad un nuovo

ambiente, nuoto forzato). Ma per poter dire che questi studi possano avere una ricaduta nella salute

dell’uomo, bisogna pensare se sono stress rilevanti per la specie. Sono stati utilizzati molti modelli

nell’animali di tipo sociale, quali: isolamento, affollamento, allontanamento dalla madre, perdita della

posizione gerarchica, interazioni aggressive.

Studio di modello psicosociale cronico

Prelevando un topo e inserendolo nella gabbia del topo 1 si identificava un topo residente e uno intruso. I

due topi litigavano continuamente per 10 minuti e successivamente si aggiungeva un divisorio e venivano

messi in contatto per mezz’ora e ritornavano a litigare. Alla fine dello studio sono riusciti ad individuare chi

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tra i due topi vinceva o perdeva: il topo residente poteva diventare dominante, subordinato e l’intruso

poteva diventava dominante oppure diventava subordinato. Per tutto il tempo per cui gli animali erano divisi,

questi non erano completamente separati in quanto sapevano della presenza dell’altro. Rispetto ai topi che

erano presenti in una gabbia normale, i topi residenti subordinati erano sottoposti a notevoli livelli di stress

con una riduzione del sistema immunitario. La perdita dello status era uno stress tale che portava alla

diminuzione del sistema immunitario.

Un secondo esperimento è stato condotto su vitelli che erano sottoposti ad ambienti di diverse dimensioni.

Animali che erano allevati in ambienti ristretti avevano una risposta immunitaria inferiore rispetto agli

animali che crescevano nei box più grandi.

Analizzando delle vacche da latte, trasportate da una stalla del piacentino ad una del lodigiano e sottoposti

ad un’ora di viaggio, analizzando la produzione di latte, la produzione di cortisolo e la proliferazione

linfocitaria, si è visto che una settimana dopo il trasferimento non si raggiungono gli stessi livelli di

produzione di latte rispetto al quantitativo precedente. Pertanto, i trasporti di meno di un’ora sono eventi

stressanti.

In esperimenti condotti sull’uomo si procede con somministrazione di test visivi o cognitivi, di problem

solving, brevi stress psicologici con presentazione in pubblico su un argomento a sorpresa, oppure utilizzare

eventi di vita stressanti come il lutto, esami accademici, comunicazione di una diagnosi di malattia.

Lo stress acuto danneggia l’immunità ma non a lungo termine. In questo studio si è vista la capacità dello

stress cronico di alterare la risposta al

vaccino influenzale. Effettuando delle

piccole biopsie cutanee si vede che nei

soggetti più stressati si ha un tempo di

guarigione maggiore. Quando si ha uno

stress mantenuto cronicamente nel

tempo si ha un notevole impatto

nell’organismo, mentre se si ha uno stress

acuto si ha la capacità di reagire.

È importante della psicologia e del

recepimento dello stress a certe situazioni

in quanto può impattare sulla risposta

biologica. La risposta biologica che si attiva in seguito ad una situazione stressante diminuisce molte funzioni

del sistema immunitario non basta solo questo per aumentare la morbilità o la mortalità:

- esposizione ad un patogeno

- vulnerabilità individuale

- stress ripetuti o cronici

- concomitanza di più episodi stressanti 37

18/04/18

Fisiopatologia del dolore

Il dolore è una sgradevole esperienza sensoriale ed emozionale associata ad un danno tissutale attuale o

potenziale, o descritto come tale. Collegato al dolore vi è un sentire fortissimo che condisiona moli aspetti

della nostra vita.

Classificazione del dolore

Secondo la patogenesi

• Ad esempio, dolore nocicettivo, dolore neuropatico

o

Secondo la durata

• Dolore acuto

o Dolore cronico

o

Secondo la sede d'insorgenza

• Ad esempio, dolore addominale, dolore arto inferiore

o

Secondo la causa

• Ad esempio, dolore da cancro, dolore postoperatorio

o

Classificazione secondo la durata (dolore acuto):

Dolore acuto (nocicettivo) è causato da una lesione o danno esterno o interno la sua intensità si correla con

lo stimolo scatenante, può essere ben localizzato e ha una precisa funzione di allerta e protezione e ha come

fine ultimo la protezione dell’integrità dell’organismo. Nelle malattie in cui si ha la perdita della sensibilità

dolorifica, come nel caso della lebbra, dove si hanno ampie parti dell’organismo che non sento alcun tipo di

dolore, si ha la perdita di tessuto.

Dolore cronico: persiste per più di 6 mesi, non è sempre riferibile ad un evento causale, diventa una patologia

a sé stante, la sua intensità non è sempre correlabile con lo stimolo causale, ha perso la sua funzione di

avvertimento e protezione. È una particolare sfida terapeutica. In presenza di uno stimolo adeguato esterno

(meccanico, termico, acido, basico ecc.) deve essere trasformato in un segnale elettrico, mediante la

trasduzione. Il neurone depolarizzato manda il segnale elettrico e si ha la trasmissione del segnale dal punto

dove si ha lo stimolo nocivo al SNC. Su tutto il sistema si ha un sistema di modulazione, ad opera del SNC, in

modo tale che ciò che arriva al cervello solo ciò che è realmente intenso. L’organo che percepisce il dolore è

la corteccia. Fino a quando siamo nel processo di trasmissione non si ha ancora dolore. Il SNC non è l’unico

organo al quale arrivano le informazioni dolorifiche, ma si hanno anche inibizioni discendenti che modulano

la trasmissione verso il cervello stesso.

La trasformazione di uno stimolo doloroso in uno stimolo elettrico avviene grazie ai nocicettori. sono

terminazioni nervose libere delle fibre Aδ e C, sono distribuiti a livello di cute, muscoli, periostio, capsula

esterna dei visceri, parete vascolare e degli organi cavi e possono essere eccitati da vari tipi di stimoli, per

esempio stimoli fisici, meccanici e chimici.

Fibre Aδ

• fibre nervose a rapida conduzione, ricoperte da una sottile guaina mielinica

– velocità di conduzione: circa 15-20 m/s (2-40 m/s)

– conducono il primo dolore “pungente”

– responsabili principalmente dell’allontanamento (riflesso di fuga) come ritrarre un arto da

– una sorgente di pericolo 38

Fibre C

• amieliniche, fibre nervose a lenta conduzione

– velocità di conduzione: circa 1-2 m/s

– responsabili del secondo dolore, “sordo”

A livello della cute si hanno delle fibre libere, nocicettori, che dalla cute trasducono il segnale verso il SNC

fino ad arrivare al corno dorsale del midollo spinale. Vengono definiti come i neuroni sensoriali afferenti

primari. Nelle corna dorsali del midollo spinale si ha una sinapsi con un secondo neurone che decussa

controlateralmente e sale al cervello attraverso il tratto talamico laterale del midollo spinale (tratto di

Gowers).

Il nocicettore è ricco di recettori e canali, in particolare vi sono dei canali che non hanno bisogno di ligandi

per aprirsi, come alcuni canali che sono termosensibili, altri sensibili al pH, ossia si aprono in presenza di

noxa. Tra i più importanti vi è il recettore TRPV1. è un canale cationico permeabile al Ca e al Na. Quando si

apre depolarizzazione e potenziale d’azione. Si apre a seguito di temperature > 45°C e concentrazioni

protoniche (pH<5.5). Questo canale si apre a seguito del legame con la capsaicina (peperoncino rosso) che

eccita le terminazioni nervose nocicettive legandosi al TRV1. Un altro canale molto importante è ASICS, che

si apre quando la concentrazione protonica è elevata, come a seguito della morte cellulare. È responsabile

del forte dolore che si ha durante l’infarto. Un altro canale è il P2X receptor che si apre a seguito del legame

dell’ATP, che se viene a trovarsi in ambiente extracellulare è in grado di comportarsi da nt a seguito di morte

cellulare. Molto importanti sono anche il recettore della bradichinina (G receptor) e prostaglandine. La

bradichinina agisce su recettori B1 e B”, GPCR. Sono accoppiati ad una isoforma speciale di PKC (PKCepsilon)

che fosforila TRPV1 e facilita l’apertura del canale. Stimola la produzione di Prostaglandine. La bradichinina

è una sostanza che normalmente non è presente nei tessuti, ma presente nel sangue che a seguito della

rottura dell’endotelio si ha l’accumulo di bradichinina. Bastano poche molecole di bradichinina per

fosforilare il canale. Le prostaglandine non causano dolore, ma aumentano l’effetto antidolorifico di altre

sostanze: diminuiscono attività di canali al K, e fosforilano gli altri recettori e canali. PKA e PKC. Basta sola

attivare il recettore delle PGE per rendere il sistema più sensibile alle sostanze dolorifiche.

I nt che vengono implicati nella via dolorifica sono: glutammato e la sostanza P (peptide di 11 aa). I

neurotrasmettitori post-sinaptici inducono l’insorgenza di un potenziale d’azione, che determina

un’ulteriore trasmissione del dolore. La trasmissione che sale al cervello arriva al talamo. Nel talamo tutti

questi stimoli vengono distribuiti alle varie aree cerebrali. Nel cervello si ha un’importante sistema

modulatorio degli stimoli che arrivano. In presenza di dolore si ha una prima fase di aumento dell’attenzione,

mentre un dolore severo può causare la perdita della coscienza.

Sostanze reticolare -> Influenza la coscienza (un dolore lieve aumenta l’attenzione, un dolore severo

• può causare perdita di coscienza)

Midollo allungato -> Stimola i centri respiratori e cardiovascolare

• Talamo -> Stazione di collegamento: distribuzione dei segnali alle varie aree cerebrali, inclusa la

• trasmissione alla corteccia cerebrale

Ipotalamo e ipofisi -> Risposta endocrina ed ormonale (ad esempio, rilascio di b-endorfina)

• Sistema limbico -> Regola la soglia del dolore e le reazioni emozionali

• Corteccia cerebrale -> Percezione dello stimolo come dolore

Inibizione discendente del dolore a livello spinale

L’inibizione discendente è un meccanismo di difesa dell’organismo contro il dolore. Avviene attraverso

sostanze monoaminoergiche. I meccanismi inibitori centrali vengono attivati per modulare il dolore a livello

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spinale attraverso le vie discendenti. I neurotrasmettitori implicati sono noradrenalina e serotonina. Le

endorfine vengono rilasciate dagli interneuroni spinali e sovraspinali durante l’evento nocivo. Si legano ai

recettori per gli oppiacei pre e post sinaptici, quindi inibiscono il rilascio di neurotrasmettitori e la

trasmissione del dolore, aumentando la stabilità di membrana. I meccanismi inibitori spinali sono modulati

anche dalle fibre β.

Il dolore cronico

Ci sono delle cause fisiopatologiche dovute a sua volta da:

- Sensibilizzazione periferica

- Sensibilizzazione centrale

Tutti questi processi amplificano gli effetti degli stimoli nocicettivi, aumentando la trasmissione della

stimolazione del primo neurone afferente. Un effetto tangibile di questo fenomeno è l’iperalgesia cioè la

percezione di un forte dolore a seguito di uno stimolo normalmente doloroso. Si può giungere all’allodinia,

cioè la percezione di forte dolore a seguito di uno stimolo non doloroso (es pazienti HIV che overstimolano i

recettori dolorifici della pianta del piede e non riescono più a camminare). Nella fisiopatologia del dolore,

il termine sensibilizzazione indica lo sviluppo di una maggior risposta ad uno stimolo, in seguito ad un

contatto ripetuto.

- La sensibilizzazione periferica è l’aumento della reazione ad uno stimolo lì dove si presenta

il dolore. Quando lo stimolo persiste per molto tempo si ha l’induzione dell’infiammazione neurogena

Le fibre afferenti C rispondono allo stimolo attraverso il rilascio di neuropeptidi in periferia sostanza

P, peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP), neurochinina A. Riduzione della soglia di

stimolazione dei nocicettori periferici

Attivazione di neuroni silenti

o Attività spontanea senza stimolo doloroso

o Infiammazione neurogena con iperreattività ai mediatori dell’infiammazione

o Coinvolgimento del simpatico

o Coinvolgimento fibre β

o Reclutamento di altri nocicettori vicini

o Stimoli non dolorosi sono ora capaci di attivare i nocicettori (iperstesia-allodinia)

o

- La sensibilizzazione centrale coinvolge meccanismi spinali e sovraspinali di persistenza,

intensificazione e/o mancata inibizione. La sensibilizzazione centrale è uno stimolo doloroso

persistente causa un’eccessiva eccitazione dei neuroni spinali (sensibilizzazione centrale), in

particolare come risultato dell’attivazione di recettori NMDA (fenomeno del “wind-up”).

Modificazioni plastiche aumentano la densità recettoriale -> cronicizzazione del dolore.

Importante ruolo del SIMPATICO

Il dolore neuropatico è causato dalla lesione dei sistemi nervoso che provoca l’attività abnorme

direttamente lungo le vie periferiche o centrali che trasmettono il dolore. Es. amputazione

Uno degli obiettivi della terapia del dolore è quello di prevenire che il dolore da acuto possa diventare

cronico. Se il dolore è già cronico, si devono conoscere i meccanismi fisiopatologici alla sua base, al fine di

attivare i necessari provvedimenti terapeutici. Il momento fondamentale che segna il passaggio verso un

dolore cronico e che può portare verso un quadro di sofferenza neuropatica è la sensibilizzazione periferica

e centrale. Conoscendo i meccanismi alla base del dolore:

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- Dolore acuto o in sensibilizzazione periferica si può agire con i FANS, e in studio ci sono molti farmaci

che vanno a bloccare il TRPV e anche antagonisti dei recettori colinergici

- Uso di anestecici locali che bloccano il canale del sodio e la trasmissione del dolore

- Nella sinapsi del midollo spinale agiscono gli oppiodi (morfina e derivati) che trovano recettori sia

sulle pre-sinapsi sia sulle post-sinapsi e bloccano la trasmissione del dolore. Agiscono anche sul

dolore cronico.

- Potenziare i sistemi discendenti inibitori, mediante l’uso di antidepressivi.

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19/04/18

Metodiche

Valutazione degli effetti dei farmaci e trattamenti farmacologici nell’attività immunitaria: capacità delle

cellule del sistema immunitario di produrre citochine, che non sono prodotte solo dal sistema immunitario

ma anche dal sistema nervoso. I linfociti sono deputati alla produzione di citochine, volendo vedere se il

farmaco impatta sulla produzione di citochine si possono analizzare direttamente i livelli di citochine oppure

l’mRNA che porta alla produzione di citochine, in modo da capire come agisce il farmaco. Molto spesso

bisogna valutare i diversi livelli di espressione di una proteina per vedere come funziona il farmaco. Le cellule

del sistema immunitario non stimolate producono una concentrazione molto bassa di proteina e per valutare

l’impatto del farmaco in vitro, ci si avvale di attivatori policlonali, che attivano le cellule del sistema

immunitario e le cellule rispondono rilasciando citochine. Tra gli attivatori policlonali più diffusi ci sono la

nectina, che si lega a delle glicoproteine presente sulla superficie delle cellule T e stimola il rilascio di

citochine.

Somministrando un farmaco ad un topo, si procede con il prelievo della milza (organo secondario linfoide)

nel quale i linfociti T, B e macrofagi vengono stoccati. Si stimolano le cellule della milza con il mitogeno

policlonale e si lasciano in coltura per 24-48h. per misurare la citochina che è stata rilasciata in vitro,

valutando la quantità della proteina si può procedere con ELISA, ossia una reazione immunoenzimatica

usando degli anticorpi specifici. Nelle piastre vengono piastrati gli anticorpi primari che sono specifici contro

la citochina che si vuole analizzare e si insediano in specifici pozzetti, si procede con lavaggi per rimuovere

l’anticorpo non legato e si procede al prelievo del surnatante rilasciato dalle cellule. La citochina in esame,

presente nel surnatante, viene a legarsi con l’anticorpo primario. Viene aggiunto un anticorpo secondario

contro la citochina che viene così intrappolata tra l’anticorpo primario e l’anticorpo secondario. Viene

aggiunto un enzima, un substrato e si sviluppa una reazione colorimetrica, dove in relazione alla quantità di

citochine si otterrà un’intensità crescente di colore. Gli anticorpi secondari sono spesso biotinati e gli enzimi

sono spesso legati all’avidina, che presenta 4 siti di legami per la biotina. La reazione avidina-biotina serve

ad amplificare la reazione colorimetrica. Quando si procede con l’ELISA bisogna avere una curva di

riferimento in modo da avere delle concentrazioni crescenti di citochina in funzione delle assorbanze. dalle

curve di tarature si estrapolano le concentrazioni di campione.

Cerando di capire come una proteina diminuisce la propria attività, si analizza l’mRNA della proteina in esame

mediante una real-time PCR. Sono richiesti dei primer senso, antisenso e sonde specifici per la citochina in

esame. si utilizza un cDNA, una sonda fluorescente e una TAQpolimerasi 5’->3’ in modo da estendere il

primer. Il cDNA viene ottenuto a seguito di estrazione dell’RNA dalle cellule, che viene quantificato e

mediante la trascrittasi inversa si ottiene il cDNA. Per l’estrazione vengono usate delle soluzioni fenoliche,

dove le cellule in contatto con questa sostanza vengono omogenizzate. L’RNA viene separato dalle cellule

mediante cloroformio che permette di ottenere una fase acquosa superficiale contente l’RNA e una fase

proteica e di DNA sottostante. Si recupera la fase acquosa e di procede con la precipitazione dell’RNA che

verrà lavato con etanolo. L’RNA isolato viene quantificato e si procede con un’analisi di qualità, dove si

rapportano R l’assorbanza dell’RNA e l’assorbanza delle proteine. Se 1.8<R<2.1 si ha un grado di purezza

dell’RNA molto buono. Si procede con la retrotrascrizione, denaturazione, ibridazione. La sonda

fluorescente è costituita da due estremità: una fluorescente e una che silenzia la fluorescenza. Quando la

sonda è libera in soluzione le due estremità sono molto vicine e la luminosità emessa dall’estremità

fluorescente viene nascosta dall’estremità che non emette fluorescenza. Quando la TAQ estende il primer si

inizia a rilevare fluorescenza. Quando effettuano queste reazioni di amplificazione fluorescente si ottengono

dei diagrammi di fluorescenza in base al numero di cicli di amplificazione. Si hanno dei punti salienti: base

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line sotto la quale si ha un’amplificazione aspecifica, una parte esponenziale, dove tutti i reagenti della

reazione sono in quantità rilevante, fase di plateau dove i substrati della reazione sono andati in esaurimento

e il ciclo della soglia, dove si ha il superamento della base line e inizia la fase di amplificazione vera e propria.

Quando si effettuano queste reazioni e si vuole quantificare una specifica citochina si quantifica anche un

controllo endogeno, che è un gene molto espresso e la cui funzione non è influenzato dal trattamento

farmacologico in esame. Il controllo endogeno dal ciclo della soglia del gene di interesse e si ottiene la

normalizzazione, in modo da l’RNA venga sottostimato, sovrastimato o si assista ad una perdita del

campione.

Per valutare la corrispondenza cellula-citochina si procede con l’utilizzo di elyspot, che permette di ottenere

una corrispondenza cellula proteina, mentre un altro modo è quello di bloccare la citochina che viene

prodotta all’interno della cellula mediante l’uso di tecniche di citofluorimetria. L’elyspot è simile all’ELISA,

servono anticorpi specifici per la citochina e vengono usate le cellule che producono la citochina, gli anticorpi

catturano la citochina in esame, viene introdotto l’anticorpo secondario, si aggiunge l’enzima e il substrato

specifico, si analizzano al microscopio il numero di spot che si ottengono. In questo modo si riesce a capire

quante cellule producono citochine.

Per vedere le citochine all’interno della cellula, le cellule vengono stimolate con il mitogeno e mediante l’uso

di golgi-stop (dove le citochine vengono intrappolate al suo interno), si usano degli anticorpi legati a

fluorocromi e si analizzano al citoflorimetro, oppure si possono analizzare utilizzando delle biglie

magnetiche. Usando degli anticorpi specifici per il CD3 coniugati con delle biglie magnetiche e inserendole

in un campo magnetico si possono isolare le cellule che esprimono il CD3.

L’anticorpo coniugato a fluorocromi viene colpito da un fascio di luce laser dando luogo al side scatter e

forward scatter, dove fs dipende dalle dimensioni, forma e caratteristiche di superficie della cellula, mentre

ss è sensibile alle inclusioni della cellula e alla sua granulosità. Si ottengono dei grafici a plot.

I farmaci esplicano la loro azione interagendo con dei recettori e per capire i suoi effetti sono mediati da un

recettore si possono utilizzare due diverse strategie: una strategia farmacologica mediante l’uso di

antagonisti specifici oppure mediante l’utilizzo di topi KO. Per la produzione KO viene usato il fenomeno della

ricombinazione omologa, dove in un vettore vengono inserite due sequenze omologhe del gene che si vuole

eliminare e si inserisce un gene che codifica per la neomicina e un gene che codifica per la timidina chinasi.

Se avviene ricombinazione omologa si perde il gene TK. Prelevando delle cellule staminali embrionali e

facendole cresce in terreni di coltura contente neomicina, se è avvenuta ricombinazione omologa le cellule

vivono. Le cellule vengono inserite all’interno della blastocisti che viene inserita in un topo femmina

pseudogravida e si generano dei topi chimera, e continuando ad incrociare la progenie si ottengono dei topi

dove si ha il gene di interesse deleto. 43


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AUTORE

yetapia

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia applicata alla ricerca biomedica
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher yetapia di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Farmacologia cellulare e molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Sacerdote Paola.

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