Elaborato maturità: ingegneria genetica, come isolare un gene

Anno Scolastico 2020/2021

Elaborato

Urbani Verdiana Paolina VB

IISS Nicolucci-Reggio

ITAS - Chimica, Materiali e Biotecnologie

Articolazione Biotecnologie Sanitarie ingegneria genetica

Come isolare un gene

A partire dalla metà del secolo scorso, grazie a numerose scoperte relative al ruolo del DNA e degli enzimi, in particolare a quelli di restrizione e alla trascrittasi inversa, si è sviluppata una nuova branca delle biotecnologie, l’ingegneria genetica.

Tale disciplina raccoglie in sé tutti gli studi e le sperimentazioni riguardanti le tecniche che permettono di isolare, manipolare e clonare determinati geni e introdurli in un organismo differente, creando, in questo modo, organismi ricombinati con caratteristiche diverse da quelli originari.

Per editing del genoma si intende, proprio l’insieme di 4. Si può ottenere il gene per sintesi chimica a partire tecniche che danno la possibilità di modificare o sosti- dai singoli nucleotidi da cui è composto.

tuire piccole porzioni della sequenza del DNA degli or- Gli enzimi di restrizione ganismi viventi senza spostarla dalla sua posizione na- Sono enzimi che riescono a tagliare il DNA in sequenze turale nel genoma, per produrne uno più adatto a ri- più brevi e permettono di individuare il gene di inte- spondere a specifiche esigenze.

Queste procedure di editing genomico, però, vennero sviluppate successi- vamente rispetto a quelle che sfruttano l’ingegneria tare il DNA virale prima che possa replicarsi all'interno genetica, nelle quali, prima di agire con le eventuali della cellula, ma non riescono a tagliare il DNA batte- modificazioni del genoma di un organismo, bisogna rico (protetto da metilazione).

Queste “forbici” moleco- identificare un gene per poi tagliarlo e isolarlo dalla lari riescono a scindere il legame tra il gruppo ossidrile molecola del DNA, unire il gene ottenuto a un vettore dell'estremità 3’ e il gruppo fosfato nell’estremità 5’ del DNA e trasferirlo all’interno di una cellula ricevente.

Negli ul- DNA ma solo se riconoscono specifiche sequenze, siti timi decenni le ricerche più avanzate hanno condotto di restrizione, costituite da 4-6 nucleotidi spesso palin- allo sviluppo di tecniche sempre più precise per pre- dromi.

parare, sintetizzare, analizzare e ibridare segmenti spe- Gli enzimi di restrizione si classificano, in base al taglio cifici di DNA, e di metodiche sempre più maneggevoli che effettuano, in: per trasferirli in siti specifici, clonarli, selezionarli otte-

• Simmetrici: l’enzima taglia al centro della sequenza nendone frammenti corrispondenti ai geni desiderati, e di restrizione producendo sequenze complemen- associarli fino a ottenere cromosomi artificiali. tari della stessa lunghezza;
• Asimmetrici: il taglio viene fatto sfalsato o obliquo generando filamenti con l'estremità 5’ più lunghi rispetto a quella 3’ o viceversa. L'estremità a sin- golo filamento che vengono prodotte sono dette coesive in quanto suscettibili di perfetto accoppia- mento con sequenze di basi complementari favo- rendo, così, la ricombinazione dei frammenti di DNA.

Esistono alcuni enzimi di restrizione che riconoscono siti diversi ma lasciano estremi compatibili e sono detti isocaudameri.

Per la ricombinazione dei frammenti di DNA è necessario ricreare i legami fosfodiesterici tra nucleotidi adiacenti per mano di particolari enzimi chiamati ligasi che richiedono ATP e specifiche temperature.

Come isolare un gene

Il gene di interesse può essere isolato in diversi modi, in generale le tecniche utilizzate sono quattro:

1. Si può estrarre il gene direttamente dalle cellule per mezzo di enzimi di restrizione: si otterranno in questo modo frammenti di DNA clonati che formano le cosiddette librerie geniche a cui attingere per ottenere i geni da trasferire in un altro organismo. Questo metodo, però, richiede molto tempo e risorse;
2. Si può sintetizzare il gene a partire dallo specifico mRNA ricavato da cellule che lo posseggono grazie all’utilizzo della trascrittasi inversa;
3. Si può sfruttare le reazioni a catena della polimerasi PCR in cui si parte direttamente dal DNA;
4. Si può ottenere il gene per sintesi chimica a partire dai singoli nucleotidi da cui è composto.

Ingegneria genetica

L’elettroforesi e sonde molecolari

L’elettroforesi su gel di frammenti del DNA

Quando si tratta il DNA con enzimi di restrizione si produce una miscela di frammenti di lunghezza diversa. Per separarli si utilizza l’elettroforesi su gel che sfrutta le differenze dimensionali e fisico-chimiche dei frammenti di DNA, molecola carica elettricamente e di conseguenza ha la capacità di migrare all'interno di un campo elettrico.

Tale tecnica prevede l'utilizzo di una matrice di separazione, solitamente gel d'agarosio che funge da rete in quanto i frammenti di DNA durante la migrazione si separano in base alla loro lunghezza o al peso molecolare.

La porosità dell’agarosio dipende dalla sua concentrazione, ma generalmente lo si utilizza al 0,8-2 % che permette di differenziare frammenti che vanno dai 200/500 bp alle 20kbp (per separare molecole più piccole è necessario ricorrere al gel di poliacrilammide).

La matrice deve essere disciolta in un tampone di corsa (soluzione salina che serve a mantenere costante il pH e la ionizzazione delle molecole da separare) con il quale è saturato il supporto per consentire il passaggio della corrente continua.

L'agarosio sciolto nel tampone è depositato e fatto solidificare in un supporto in cui sono creati diversi pozzetti allineati in cui successivamente saranno depositati i campioni.

A questo punto, il gel completamente sommerso dal tampone è sottoposto a un campo elettrico costante per 20-30 minuti. A fine corsa i frammenti di DNA possono essere osservati solo dopo colorazione con coloranti fluorescenti.

Localizzare un gene tramite sonde molecolari

L'individualizzazione del gene di interesse si realizza impiegando sonde che sfruttano la caratteristica della complementarietà delle singole basi azotate per cui le sequenze spaiate hanno una naturale tendenza ad accoppiarsi con quelle complementari. lavaggi si procede alla rivelazione dell’ibrido target/sonda.

Le sonde molecolari

Per la ricerca del gene target è possibile ricorrere all'uso di sonde molecolari a DNA o RNA (probes). Sono frammenti specifici marcati radioattivamente o con fluorocromi che possono ibridare.

Affinché avvenga l'ibridazione sia la sonda che l’acido nucleico devono trovarsi in forma di singoli filamenti per cui devono inizialmente essere denaturati e miscelati.

Le sonde possono essere sintetizzate mediante clonazione del DNA in vettori molecolari; attraverso l’uso della trascrittasi inversa formando cDNA; attraverso la PCR; oppure per sintesi chimica partendo da nucleotidi trifosfati modificati.

La scelta del marcatore dipende dal tipo di risoluzione desiderata, dalla sensibilità, dalla stabilità nel tempo e dai rischi connessi alla sua manipolazione. Le sonde in base a questo criterio possono essere:

• Calde: sono formate da isotopi radioattivi (³²P, ³⁵S) e sono molto sensibili. La rivelazione prevede l'uso di lastre autoradiografiche;
• Fredde: sono più stabili e di uso meno problematico si ottengono marcando i nucleotidi con:

• Fluorocromi (fluorosceina) prevede una rivelazione diretta;
• Biotina (vitamina) prevede una rivelazione indiretta con tecniche immunoenzimatiche o con anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromi;
• Digossigenina (steroide).

Tecniche di ibridazione

Sono numerose le tecniche utilizzate a questo scopo ma in generale si possono dividere in due grosse categorie: su filtro e in situ.

Su filtro

L’ibridazione avviene fra la sonda in soluzione e un ac. nucleico immobilizzato su filtro di nylon o di nitrocellulosa.

Essa prevede il trasferimento su filtro degli ac. nucleici bersaglio denaturati, il loro fissaggio sul supporto mediante calore o raggi UV, successivamente una preibridazione con un tampone.

A questo punto si procede all’ibridazione vera e propria con il tampone e la sonda marcata e denaturata, infine, dopo una serie di lavaggi si procede alla rivelazione dell’ibrido target/sonda. Tra le tecniche di ricerca diretta di sequenze polinucleotidiche abbiamo:

• Southern blotting in cui il campione di DNA è digerito con enzimi di restrizione, i frammenti ottenuti sono separati mediante elettroforesi e successivamente sono denaturati con soluzioni alcaline, neutralizzati e trasferiti su nitrocellulosa e fissati. Il filtro è infine esposto all'azione di una sonda. Questa tecnica consente di identificare e analizzare i polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione e di analizzare la presenza di specifiche mutazioni, il loro rapporto con una malattia genetica e il numero di copie di un gene nel genoma;
• Northen blotting molto simile a quella precedente ma sul filtro è trasferito il RNA anziché il DNA e la sonda può essere sia a DNA che a RNA;
• Dot-blot il DNA o l’RNA sono posti direttamente sul filtro che poi è ibridato con una sonda. Questa tecnica è utilizzata in diagnostica microbiologica per la ricerca di microrganismi patogeni. È un test utile per selezionare le cellule trasformate ricombinanti da quelle non ricombinanti.

In situ

Questa procedura è usata per verificare la presenza o meno di una sequenza e per identificare sul quale cromosoma o in quale posizione è posizionato un gene.

Può avere come target:

• RNA citoplasmatico: su un vetrino vengono poste cellule permeabilizzate in modo da permettere l'ingresso della sonda. Questo metodo è abbinato spesso a colture cellulari che permettono di mostrare come determinate molecole modificano l’espressione dati di geni;
• DNA cromosomico: consente di localizzare direttamente un gene sui cromosomi in metafase, in questo caso il risultato non è la presenza di un gene ma la specifica porzione cromosomica. È condotta quando si sospetta che sia avvenuta una traslocazione cromosomica (es. tumori o malattie genetiche).

Ingegneria genetica

Vettori molecolari

Inserire geni nelle cellule: i vettori molecolari

L'introduzione di molecole di DNA esogeno si chiama trasformazione se avviene in una cellula ospite batterica o trasfezione quando riguarda le cellule eucariotiche.

Questo processo avviene tramite l'uso di vettori molecolari, elementi genetici extracromosomici che possono contenere e trasportare un frammento di DNA, inserto, e mantenerlo stabile nella cellula ospite.

Tutti i vettori devono rispettare una serie di requisiti affinché possano essere usati, i più importanti sono:

• La facilità nel penetrare nella cellula ospite;
• La stabilità e la compatibilità con la cellula ospite;
• La capacità di replicarsi in modo autonomo;
• La presenza di siti di restrizione unici per ogni enzima di restrizione in modo che il vettore si tagli in un unico punto;
• La presenza di geni marcatori selezionabili che permettono l'identificazione e l'isolamento delle cellule ricombinanti.

I vettori possono essere di varia natura ma i maggiormente diffusi sono i plasmidi (vettori batterici), i virus e i loro derivati ingegnerizzati.

I plasmidi

Sono molecole circolari di DNA extracromosomico dotati di replicazione autonoma. Non sono indispensabili però conferiscono ai batteri che li possiedono caratteristiche fenotipiche particolari.

Sono i vettori più utilizzati per le loro piccole dimensioni e per la loro facilità di trasferimento di geni ma hanno il limite di non poter ospitare frammenti di DNA esogeno non più grandi di 10 000 nucleotidi.

Al fine di poter funzionare come vettori, i plasmidi, devono presentare una regione dove sono raggruppate tutte le sequenze uniche di riconoscimento dei principali enzimi di restrizione, sito multiplo di clonaggio, che impedisce il taglio in altre zone del plasmide non interrompendo geni fondamentali per la sua integrità funzionale.

Nelle tecniche di trasferimento è possibile che il gene non riesca ad entrare nel plasmide e quindi si genera un plasmide non ricombinato oppure si riesce ad ottenere il plasmide ricombinato ma le cellule ospite non lo acquisiscono.

Pertanto i possibili risultati dell’utilizzo di questi vettori sono tre: si possono ottenere cellule ospite senza plasmide, cellule ospite con il plasmide ma non ricombinato o cellule ospite con il plasmide ricombinato.

È indispensabile disporre dei geni marcatori che permettono il riconoscimento delle cellule ricombinanti.

Alcuni di questi geni sfruttano il fenomeno dell’inattivazione inserzionale cioè inserire il DNA ricombinante in un gene per l’espressione di un’altra caratteristica.

I geni marcatori più usati sono quelli che conferiscono la resistenza a un antibiotico, per cui è sufficiente far crescere le cellule batteriche in presenza dell’antibiotico specifico per poter selezionare le cellule trasformate.

Il pBR322 fu il primo plasmide artificiale contenente il gene per la resistenza all'ampicillina, il gene per la resistenza alla tetraciclina, un’origine della duplicazione (ori), i siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione specifici.

In questo caso il DNA esogeno viene inserito nel gene della resistenza alla tetraciclina. Il batterio contenente questo plasmide viene, dapprima coltivato su terreni di coltura generici, cresceranno soltanto le colonie con il plasmide ma non ricombinante.

Dunque le colonie che devono essere prese in considerazione saranno quelle cresciute nella seconda piastra ma non nella terza. Questa tecnica viene chiamata replica plating.

Alcuni vettori di clonaggio sono stati costruiti per velocizzare e facilitare lo screening dei cloni ricombinanti utilizzando diversi marcatori di selezione e sfruttando il fenomeno di inattivazione inserzionale chiamato α-complementazione.

Fanno parte di questo gruppo i pUC (plasmidi relativamente piccoli presenti nella cellula ospite in circa 500 copie. Essi possedendo un'origine Ori, un polylinker, il gene per la resistenza all'ampicillina e presentano il promotore e la regione LacZ - marcatore di selezione che serve per sintetizzare l’enzima -.

I batteri ottenuti vengono introdotti in un terreno di coltura in cui è presente lo X-Gal se questo composto viene degradato si deduce che le cellule batteriche non hanno incorporato il plasmide ricombinante).

Oggi molto utilizzate sono le proteine GFP che generano una fluorescenza verde molto intensa e che può essere introdotta in tutti i sistemi biologici senza risultare tossica.

Batteriofagi

Sono virus frequentemente utilizzati come vettori per trasferire i geni in cellule procariotiche. Riescono a contenere DNA esogeno di dimensioni superiori rispetto e i plasmidi. Il principale è il fago λ.

Cosmidi

Possiedono sia il sito di clonaggio multiplo e dei marcatori di selezione tipici dei plasmidi sia l’estremità del DNA del fago. Possono supportare inserti di elevate dimensioni e replicarsi come un plasmide.

BAC (cromosomi artificiali batterici)

Sono derivati dal fattore F degli E. coli. Sono utilizzati per clonare grandi frammenti di DNA poiché la replicazione del DNA eterologo avviene allo stesso modo di un cromosoma batterico.