Rappresentazione grafica di un esperimento di binding per competizione

Rappresentazione grafica di un esperimento di binding per competizione

L’andamento della curva ottenuta in un esperimento di binding per competizione è opposto rispetto a quello osservato negli esperimenti di binding per saturazione. Mentre nella saturazione aumenta progressivamente il numero di recettori occupati all’aumentare della concentrazione di ligando radioattivo, nella competizione diminuisce la quantità di ligando radioattivo legato ai recettori quando aumenta la concentrazione di ligando non marcato.
Un esempio di questo tipo di esperimento è rappresentato dallo studio dei recettori per le benzodiazepine.

Svolgimento dell’esperimento di competizione

Nell’esperimento di competizione si utilizza una concentrazione fissa e bassa di ligando radioattivo, uguale in tutte le provette. In queste condizioni, il farmaco radioattivo si lega ai recettori in una quantità ridotta, corrispondente a una condizione di elevata affinità del ligando per il recettore.
Successivamente vengono aggiunte concentrazioni crescenti di un farmaco non radioattivo, definito anche farmaco freddo o farmaco X, del quale si vuole valutare la capacità di interagire con lo stesso recettore.
All’aumentare della concentrazione di farmaco freddo, questo compete con il ligando radioattivo e lo spiazza progressivamente dai recettori. Di conseguenza, la quantità di farmaco radioattivo legata ai recettori diminuisce.
Se il farmaco freddo riesce a ridurre il legame del ligando radioattivo, significa che riconosce lo stesso recettore e compete per lo stesso sito di legame.

Interpretazione della curva di competizione

Nella rappresentazione grafica di un esperimento di binding per competizione, sull’asse delle ordinate non viene riportato il numero di recettori, perché non si lavora in condizioni di saturazione.
L’asse delle ordinate rappresenta invece la percentuale di farmaco radioattivo ancora legato ai recettori. Il 100% corrisponde alla quantità iniziale di ligando radioattivo legato in assenza di competizione.
Aumentando la concentrazione del farmaco freddo, la percentuale di ligando radioattivo diminuisce progressivamente fino a raggiungere un valore minimo, oltre il quale non è più possibile ridurre ulteriormente il legame.
Questo indica che il farmaco studiato è in grado di interagire con gli stessi recettori del ligando radioattivo.

Determinazione dell’IC50

Negli esperimenti di competizione non è possibile determinare direttamente la Kd, perché non si sta misurando il legame diretto tra farmaco e recettore in condizioni di saturazione.
Il parametro utilizzato è quindi l’IC50 (concentrazione inibitoria 50).
L’IC50 rappresenta la concentrazione di farmaco freddo necessaria per ridurre del 50% il legame del farmaco radioattivo ai recettori.
L’IC50 è una misura indiretta dell’affinità del farmaco per il recettore: più bassa è l’IC50, maggiore è l’affinità del farmaco.
Ad esempio, un farmaco con IC50 pari a 10⁻¹⁰ M possiede un’affinità maggiore rispetto a un farmaco con IC50 pari a 10⁻⁹ M, perché è sufficiente una concentrazione dieci volte inferiore per ottenere lo stesso effetto di spiazzamento del ligando radioattivo.
Al contrario, un farmaco con IC50 pari a 10⁻⁷ M presenta un’affinità inferiore, perché sono necessarie concentrazioni più elevate per ridurre del 50% il legame del ligando radioattivo.

Utilità degli esperimenti di competizione

Gli esperimenti di binding per competizione sono particolarmente importanti nell’industria farmaceutica perché permettono di confrontare rapidamente numerosi composti e stabilire se sono in grado di interagire con un determinato recettore.
Un farmaco che non riesce a spiazzare il ligando radioattivo, anche a concentrazioni elevate, non interagisce in modo significativo con quel recettore.
Al contrario, maggiore è la capacità di un farmaco di spiazzare il ligando radioattivo a basse concentrazioni, maggiore è la sua affinità per il recettore.
Questi esperimenti permettono quindi di confrontare diversi farmaci rispetto alla loro capacità di legarsi allo stesso bersaglio molecolare.
Correlazione tra affinità recettoriale e attività terapeutica: benzodiazepine
Gli studi sulle benzodiazepine hanno dimostrato una stretta correlazione tra la capacità di spiazzamento osservata negli esperimenti di competizione e l’efficacia terapeutica del farmaco.
Confrontando farmaci come il clorazepam e il clordiazepossido, il clorazepam presenta una maggiore affinità per il recettore delle benzodiazepine perché riesce a spiazzare il 50% del ligando radioattivo a concentrazioni inferiori.
Questa maggiore affinità si riflette anche nella pratica clinica: il clorazepam può essere utilizzato a dosaggi inferiori rispetto al clordiazepossido.
Il clordiazepossido possiede invece una minore capacità di competere per il recettore e quindi una minore affinità, ma rimane comunque un farmaco efficace perché richiede dosaggi terapeutici più elevati.
La correlazione tra IC50 e dose terapeutica dimostra quindi che farmaci con maggiore affinità recettoriale generalmente necessitano di dosi più basse per produrre l’effetto farmacologico.
Correlazione tra affinità per i recettori D2 e attività degli antipsicotici
Gli esperimenti di competizione sono stati utilizzati anche per studiare i farmaci antipsicotici e il loro rapporto con i recettori dopaminergici D2.
È stato osservato che i farmaci antipsicotici capaci di competere con il ligando radioattivo per i recettori D2 a basse concentrazioni sono efficaci clinicamente a dosaggi inferiori.
Al contrario, i farmaci che richiedono concentrazioni elevate per spiazzare il ligando radioattivo presentano una minore affinità e necessitano di dosi maggiori per ottenere l’effetto terapeutico.
Questi studi hanno contribuito a chiarire il ruolo dei recettori dopaminergici D2 nella schizofrenia e nelle psicosi, dimostrando una relazione tra il blocco dei recettori dopaminergici e l’efficacia dei farmaci antipsicotici.
Importanza degli esperimenti di binding
Gli esperimenti di binding consentono di identificare il bersaglio molecolare di un farmaco e di caratterizzarlo dal punto di vista farmacologico.
Attraverso questi studi è possibile determinare l’affinità di un farmaco per un recettore e prevedere, almeno in parte, la sua potenza terapeutica.
L’affinità misurata in vitro tramite esperimenti di binding è infatti spesso correlata alla dose necessaria per ottenere l’effetto farmacologico nell’organismo.