Propedeutica biochimica e biologia molecolare - Appunti

Polipeptidi

Polipeptidi divisi in:

• Globulari → Enzimi di solito con funzione tridimensionale definita.
• Fibrillari → Hanno funzione strutturale e solitamente si trovano all'esterno cellulare.

Amminoacido generico

HCOOH-C-NH₂
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R → La catena laterale ne determina le proprietà chimiche e fisiche. La catena laterale non è impiegata nei legami peptidici e nelle eliche!

Amminoacidi

Amminoacidi alifatici

Alifatici → Posseggono una catena alifatica di carboni attaccata come R.

Generalmente → Più è lunga la catena, più è idrofobico e insolubile l'amminoacido.

Glicina ha un H come R → È l'amminoacido dal minore ingombro sterico. Ha caratteristiche particolari.

Prolina è l'amminoacido con maggiore immobilità → È sostanzialmente immobile → Presenta legame fisso perché è eterociclico → L'azoto non può ruotare rispetto al legame col carbonio → Immobilità pressoché assoluta → Opposto di glicina → Legame fi inibito.

Gli amminoacidi idrofobici tendono a essere esposti all'interno della cellula.

Amminoacidi carichi e polari

Carichi → Sono esposti all'esterno della proteina e favoriscono la solubilità della proteina.

Acido aspartico, acido glutammico → [-]

Lisina, arginina, istidina → [+]

Polari → Possiedono uno o più gruppi polari che ne favoriscono solubilità.

Serina, treonina, asparagina, glutammina, cisteina, tirosina.

Quelli contenenti gruppi aromatici, triptofano W ad esempio, tendono a essere molto meno solubili.

Legame carboammidico

Legame carboammidico → Presenta una doppia forma:

I apolare R-C=O\NH₂

II polarizzata R-C-O\\NH₃⁺

Questo è dovuto al legame peptidico che è planare con angoli rigidi ed è una forma intermedia tra un legame doppio e un legame semplice.

Fenomeno: delocalizzazione energetica → Non permette libertà di movimento.

Quando due amminoacidi sono legati gli unici movimenti concessi sono:

• Angolo F (fi) C-NH.
• Angolo P (psi) C-C.

La rotazione diversa non è consentita → Quando si forma il polipeptide crolla la libertà di movimento → Questo determina la conformazione che possono assumere gli amminoacidi.

Importante: non si può determinare solo conoscendo la sequenza la conformazione del legame tra amminoacidi considerando le rotazioni → Serve una misura sperimentale.

Configurazioni del legame peptidico

Il legame peptidico tende a configurarsi in trans perché mantiene le catene laterali più distanti e quindi con meno interazioni → L'energia è più bassa e la forma per quasi tutti gli amminoacidi è 1000 volte più stabile.

Prolina → A causa della sua struttura molto immobile ha solo 4 ordini di grandezza di stabilità che variano da forma cis a forma trans → Spesso viene inserita in catena per terminarla o per cambiarne il giro.

Esistono enzimi prolina isomerasi → Che isomerizzano la prolina da cis a trans.

PKA e punto isoelettrico

Il PKA della molecola → Definisce la solubilità.

L'amminoacido dipende dal pH della soluzione.

Quando ha carica 0 si definisce zwitterione → pH del punto isoelettrico → PKA1 + PKA2 / 2.

Nei polipeptidi e proteine è misurato sperimentalmente perché sarebbe impossibile determinarlo a livello teorico.

Elettroforesi

Come si fa?

Elettroforesi → Molecole immerse in un gel che ne impedisce la libera diffusione, sottoposto a un campo elettrico con posizioni di pH → Le proteine migrano e si fermano al loro punto isoelettrico → Riesco così a separarle.

Elettroforesi → Diagnosi di patologie!

Esempio: se faccio un'elettroforesi con il plasma riesco a determinare la presenza e i valori delle proteine → Riesco a comprendere se il paziente ha un'infiammazione primaria, A2 elevate, se continua, cresce il picco di gamma globuline.

Mi rendo conto se scompaiono gamma globuline → Patologie epatiche. Sindrome nefrosica / cirrosi epatica.

Esempio: analizzando il liquido delle cavità nasali mi accorgo se è presente liquor, e ci sono state fratture che non si sono potute evidenziare mediante TAC, dalla presenza di una proteina presente solo nel liquor → Asialotransferrina → Mediante elettroforesi la evidenzio → Frattura.

Rinoliquorrea e otorinoliquorrea.

Solubilità delle proteine

Triptofano W → All'apice dell'insolubilità perché doppio anello aromatico.

Glicina è particolare e resta nel mezzo → Ha catena R corta e parzialmente polare, è un idrogeno.

Struttura primaria

Può accadere che il cambiamento di un solo amminoacido abbia un effetto drammatico, anemia falciforme.

Non sempre il cambiamento di un amminoacido ha un effetto drammatico! → La struttura funzionale può non esserne alterata.

Esempio: insulina vaccina e insulina suina-porcina → Hanno sequenza diversa da quella dell'uomo ma sono funzionalmente molto simili.

Esempio: l'insulina di origine sintetica tende in fialetta ad aggregarsi in esameri → Iniettata, l'esamero si apre con lentezza e torna in forma monomerica: questo però rallenta l'assimilazione di insulina e la curva non è la medesima di quella umana.

Soluzione → Si sostituiscono LYS - PRO nella catena modificando la struttura primaria → Si determina una variazione e non si complessano più in esameri → Curva pari a quella fisiologica.

La struttura primaria è quindi essenziale perché influisce sull'interazione.

Anemia falciforme: l'emoglobina, dominante negativo, con un amminoacido sostituito tende ad aggregarsi in desossi e ad alterare la forma dei globuli rossi.

Struttura secondaria

Una struttura più grande con la quale si costruiscono strutture ancora più grandi.

Alfa elica, foglietto beta, random coils → Come un gomitolo sparpagliato a caso → Spesso sono proteine degradate che hanno esaurito la propria funzione.

Si è osservata tale predisposizione a formare certe forme con Ramachardan → Nota andamenti fissi di legame FI C-N e PSI C-C tra amminoacidi.

Questo vale per tutti gli amminoacidi tranne per la glicina → Essa tende ad assumere tutte le forme casuali perché ha un enorme potere di mobilità e di rotazione, è la più instabile → A causa di catena R piccola.

Nella struttura secondaria non entrano a far parte le catene -R degli amminoacidi → È dovuta a affronto nelle eliche tra gruppi COO^- carichi negativamente e NH₃⁺ carichi positivamente!

Si forma un legame a idrogeno relativamente debole che mantiene la alfa elica o foglietti beta.

La alfa elica è destrorsa e parzialmente dipolare.

• Catene N+4 → Forma più stabile.
• N+3 → Condensata → Proline!!!
• N+5 → Lassa, punto dove si affrontano COO^- e NH₃⁺.

Legami a idrogeno tra NH₃⁺ e COO^- → Si forma un'estremità di elica che ha parziale carica + e un'estremità che ha parziale carica - → Dipolo.

Due amminoacidi, a causa della loro struttura, tendono a non fare struttura a alfa elica.

Prolina → A causa della sua rigidità e della possibilità di isomerare tra cis e trans → Viene solitamente inserita per cambiare forma all'elica o per interrompere.

Glicina → È troppo libera, pertanto non riesce a proseguire la struttura alfa elica.

Le catene R restano fuori.

Se gli amminoacidi hanno catene R molto polari → Tendono a non preferire alfa elica.

Se gli amminoacidi hanno grosso ingombro sterico → Tendono a non formare alfa elica.

In base alla carica, polarità o meno, dell'amminoacido nell'alfa elica gli amminoacidi hanno posizioni diverse:

• Verso fuori se sono idrofilici.
• Verso dentro se sono idrofobici.
• Struttura anfipatica se hanno una parte polare espressa verso fuori e una parte apolare espressa verso dentro.

Foglietto beta

4-2-2014

Foglietto beta → Si forma sempre riguardando i legami a idrogeno tra C=O e NH → Non implica le catene laterali R.

Due forme:

• Antiparallelo → Si affrontano estremità NH e COOH in modo sfalsato: NH COOH, COOH NH.
• Parallelo → Si affrontano estremità in modo uguale: NH NH, COOH COOH.

I paralleli possiedono spazi costanti tra gli amminoacidi.

In base a dove si affacciano e di che tipo sono le catene R, sopra o sotto, si distinguono foglietti:

• Idrofobico.
• Idrofilico.
• Anfipatici, con regione idrofobica dentro e idrofilica fuori.

Le proteine possono contenere sia alfa elica che foglietti beta, è molto raro che contengano contemporaneamente foglietti beta paralleli e antiparalleli.

Loops e struttura tridimensionale

Loops → Parti di congiunzione variabili tra alfa eliche o foglietti beta → Danno mobilità, flessibilità e permettono di collegare alfa eliche e foglietti beta.

Solitamente sono lunghi pochi amminoacidi ma possono anche essere lunghi in regione variabile anticorpi.

La struttura tridimensionale deriva dalla necessità di → Gestire interazione con ambiente acquoso.

• Interno della proteina → Parte idrofobica, core.
• Esterno della proteina → Parte idrofilica.

Esempio: proteina G è una proteina alfabetà → Si dispongono in modo che la parte interna veda l'affacciarsi della parte idrofobica dei foglietti beta e delle alfa eliche, mentre la parte esterna veda l'affacciarsi delle catene R polari → Questo fa sì che si crei un core interno idrofobico protetto da un guscio esterno idrofilico → Così si crea una fossa di legame per il ligando.

Folding → Ripiegamento tridimensionale della struttura secondaria → Se riscaldo le proteine oltre a una certa soglia esse tendono a perdere la loro struttura secondaria → Alcune sono in grado di tornare funzionali da sole, altre no.

Interazioni idrofobiche → Sono quelle più importanti che stabilizzano il core interno proteico e donano alla proteina struttura funzionale.

Ponti disolfuro

Ponti disolfuro → Si realizzano tra due residui di cisteina.

Cisteina → Cisteina SH SH → Cistina RSSR → Ponte disolfuro.

È un legame covalente → Stabilizza molto la struttura → Perché si formi è assolutamente necessario che le cisteine si trovino in una posizione corretta, sennò il legame covalente non si forma.

Non sempre sono in grado di riformarsi se rotti, un esempio è insulina sintetizzata come protoinsulina in forma inattiva che forma successivamente ponti disolfuro.

Ponti disolfuro:

• Intramolecolari → All'interno della stessa catena proteica.
• Intermolecolari → Tra due catene proteiche diverse.

Riassumendo: struttura tridimensionale → Interazioni idrofobiche del core. Legami disolfuro. Capacità di autorigenerare i legami → Per assumerla correttamente spesso sono presenti proteine ausiliarie che aiutano a creare la struttura funzionale.

Fattori addizionali e domini funzionali

Spesso la struttura primaria non basta a definire la struttura funzionale effettiva → Servono fattori addizionali.

Possono essere:

• Ioni.
• Metalli.
• Gruppi organici, EME.

La struttura tridimensionale della catena polipeptidica genera un corretto ambiente chimico fisico per accogliere il fattore addizionale → Esempio gruppo EME.

Negli eucarioti i polipeptidi sono strutturati in domini funzionali → Che si conservano e hanno struttura e posizione costante.

Un esempio: elix loop elix → È un dominio peptidico molto semplice comune a tutte le proteine che legano calcio, esempio troponina, calmodulina ecc.

Il legame con il calcio viene mediato da legami a idrogeno → Mediati da acqua H₂O → Gli amminoacidi di legame elix loop elix del calcio sono conservati e costanti.

In caso di assenza di calcio non si assiste alla formazione di alfa elica → Non si forma struttura 3D funzionale!!! → Loops continuo o random coils.

Esistono altri domini particolari → Le alfa eliche e i foglietti beta sono quindi associati in domini particolari e costanti anche in proteine diverse, come unità funzionali.

Struttura generale in ordine di complessità

• I struttura primaria: sequenza amminoacidica necessaria alla formazione di secondaria.
• II struttura secondaria: legami a idrogeno alfa elica foglietti beta, non coinvolte catene -R.
• III struttura terziaria: legami a idrogeno, coinvolte catene -R.
• IV struttura quaternaria: interazione fra più subunità proteiche.

La ripetizione di strutture semplici va a formare con domini ripetuti strutture complesse.

Esempio: chimotripsina

Chimotripsina → È un enzima piuttosto generico che non ha funzioni specifiche, degrada proteine.

Se alla chimotripsina aggiungiamo domini specifici → Esso può diventare sempre più specifico.

Mediante domini diversi creo strutture funzionali diverse sempre più specifiche. Cambiare dominio = cambiare funzionalità.

Le mutazioni più gravi per la struttura terziaria sono quelle che avvengono a livello di amminoacidi che formano il core idrofobico della proteina → Esso fornisce l'impalcatura per la struttura funzionale.

Le mutazioni di amminoacidi in superficie hanno basso impatto sulla conformazione funzionale della proteina.

Gli amminoacidi localizzati sulla superficie hanno basso impatto sulla struttura funzionale e possono differire anche nella stessa proteina umana → Il core è la struttura più importante.

Proteine basate su alfa eliche

• Proteine di trasporto.
• Proteine di membrana.
• Proteine strutturali, collagene.

Struttura coiled coil → Basata su 2 alfa eliche che si avvolgono una sull'altra.

Il passo dell'elica invece che essere ogni 3.6 amminoacidi si trova a essere ogni 3.5 amminoacidi → Ogni 7 amminoacidi vi è una leucina che si affaccia a una altra leucina formando un legame idrofobico che stabilizza l'elica → Chiamata anche leucin zipper → Legame apolare e idrofobico.

All'interno sono quindi esposte le catene -R idrofobiche che formano legami idrofobici per tenere insieme l'elica.

Coiled coil → Passo a 3.5 amminoacidi. Ogni 7 si affrontano due leucine, leucin zipper.

Le catene R polari sono esposte all'esterno → Questo consente di creare una struttura con guscio polare esterno che protegge un core interno idrofobico che minimizza il contatto con l'acqua.

Cheratine → Non sono più sufficienti i dimeri coiled coil → Essi si compattano e formano miofibrille sempre più compatti grazie a questa struttura → Tramite gruppi terminali NH e COOH.

Collagene

Collagene → Struttura a tripla elica. Struttura: glicina X Y, glicina X Y → Glicina + idrossiprolina + idrossilisina.

Struttura:

• I livello, glicina → Amminoacido più mobile, forma legami a idrogeno tra le eliche e non su elica singola affacciandosi tra un'elica e l'altra, legami idrogeno intermolecolari C=O e NH.
• II livello, idrossiprolina → Amminoacido più rigido e immobile, impacchetta le eliche consentendo alle glicine di trovarsi in posizione fissa per fare i legami a idrogeno intercatena → La prolina è idrossilata per fornire stabilità termica → Senza idrossiprolina non vi è stabilità termica.
• III livello, idrossilisina → Forma basi di Shiff e legami aldolici e stabilizza con legami covalenti ulteriormente le eliche di collagene → Funzione di crosslinks covalenti che stabilizza la struttura! → Sua assenza o riduzione anomala: sindrome di Danson.

Formazione del collagene vero e proprio: struttura a singola elica G X Y glicina idrossiprolina idrossilisina. I COOH terminali hanno una particolare glicosilazione che mantiene ancorato un capo della treccia mediante legami covalenti disolfuro → Questo fa sì che la treccia si possa formare, 3 eliche.

All'esterno della cellula daranno poi origine a collagene vero e proprio mediante rimozione dei gruppi COOH terminali glicosilati, telopeptidi.

Malattie legate al collagene

• Artrite reumatoide.
• Osteogenesi imperfetta, malattie proteolitiche del collagene.
• Sindrome di Ehlers Danson → Difetto di crosslinking dell'idrossilisina, pelle molto molto elastica perché collagene poco stabilizzato.

Struttura comune delle globine di trasporto di elettroni

Globuline, tipicamente citocromi → Solo alfa eliche!

Struttura a 4 alfa eliche inserite tra loro in modo diverso avvolgendosi → Creano un globulo idrofobico, catene R apolari esposte, in cui si inserisce il cofattore di trasporto.

Esempio: mioglobine e emoglobine.

Immunoglobuline

Immunoglobuline → Esclusivamente foglietti beta!!!

Possiedono 2 catene leggere e 2 catene pesanti → Sono tenute insieme fra loro da legami disolfuro.

Possiedono una regione costante che è costante per ogni immunoglobulina di categoria.

Possiedono una regione variabile che varia per ogni singola immunoglobulina e consente un legame doppio con antigene.

IGM - IGG coinvolte in risposta immunitaria.

IGM pentameriche → In seguito a risposta primaria si trasfor