Concetti Chiave
- La PCR è una tecnica che amplifica il DNA replicando in vitro una specifica regione del DNA genomico.
- I componenti fondamentali per la PCR includono DNA stampo, primer, TAQ polimerasi, dNTPs, buffer e magnesio.
- Il processo di PCR prevede cicli di denaturazione, appaiamento e allungamento, ripetuti 30-35 volte per ottenere miliardi di copie del DNA.
- L'elettroforesi degli acidi nucleici separa frammenti di DNA e RNA in base alla loro dimensione, sfruttando la carica negativa del DNA in un campo elettrico.
- La precisione della sequenza dei primer è cruciale per evitare self-appaiamenti e garantire l'amplificazione corretta del DNA target.
È una sorta di replicazione in vitro, mima il fenomeno naturale della replicazione in provetta. L'obiettivo è amplificare il DNA ovvero ottenere molteplici copie di una regione target del DNA.
Indice
Componenti essenziali per la PCR
Per la PCR servono:
-DNA genomico = DNA stampo, che voglio copiare.
-primer = oligonucleotidi a singolo filamento, tratti di DNA a singolo filamento costituita da pochi nucleotidi, cost da circa 20 pb. Serve per dare un innesco all’enzima. Non esiste né in natura né in vitro una polimerasi capace di attaccare nucleotidi senza un innesco. Questo perché l’innesco è una molecola di DNA che fornisce un 3’ OH libero, a cui attaccare il nucleotide successivo.
L’enzima della PCR è la TAQ polimerasi, enzima termoresistente.
-dntps =desossinucleotidi, nucleotidi del DNA.
-buffer= tampone che garantisce pH della reazione.
-magnesio= coenzima ovvero il coadiuvante della taq polimerasi.
Processo di denaturazione e appaiamento
-denaturazione= 90/95 gradi, si rompono legami H e si ottengono singoli filamenti.
-appaiamento= abbasso la temperatura da 95 a 55 e si appaiano i primer, al DNA denaturato, si andranno ad appaiare dove trovano complementarietà.
Interviene polimerasi, fase di allungamento es 72 gradi, si aggiunge un nucleotide alla volta, e lo aggiunge attaccandolo al 3’ OH libero e lo attacca in base alla complementarietà del DNA stampo. L’OH serve per creare lo scheletro del DNA, per creare legami fosfodiesterici.
Cicli di PCR e importanza dei primer
Gli step vengono ripetuti per 30/35 cicli, il risultato è che ottengo circa un miliardo di copie del DNA.
La fase critica è l’appaiamento. I primer devono avere una sequenza precisa. 20 pb perchè è più probabile trovarla 1 volta sola nel organismo anziché 6 pb che è più probabile trovarlo molte volte. Se avesse più di 20 pb rischierebbe di fare un self appaiamento, trovando i complementari con facilità.
Per fare la PCR, devo conoscere la sequenza dei primer.
In che direzione lavora la TAQ polimerasi? Attacca i nucleotidi in 5’ → 3’
Ci sono due primer: forward e reverse perché i due filamenti sono complementari e antiparalleli.
La polimerasi li attacca in base alla complementarietà del DNA stampo, smette di lavorare quando ridenaturo il DNA, in base al tempo che ho fissato.
Al 2 ciclo di PCR, denaturo e ho 4 molecole di DNA. Si ferma quando incontra un altro primer perché è finita la sequenza. Al terzo ciclo di PCR, ottengo il target DNA, dal 3 ciclo in poi il DNA target sarà preponderante.
Elettroforesi degli acidi nucleici
L’elettroforesi degli acidi nucleici permette di separare frammenti di DNA ed RNA per dimensione poiché i frammenti di minori dimensioni migrano attraverso il gel a velocità maggiore rispetto ai frammenti di maggiori dimensioni.
L’EF si basa sul principio in cui le molecole di DNA sono cariche (-) e migrano in un campo elettrico verso il polo (+) con velocità inversamente proporzionali alle loro dimensioni (in paia di basi).
Come gel elettroforetico si utilizza il gel di agarosio che è uno zucchero che crea una maglia all’interno del gel e forma pori dove il DNA può passare. Più è alta la concentrazione di agarosio più piccoli sono i pori e viceversa.
Mediante etidio bromuro, dopo aver fatto migrare il frammento di DNA, si vanno ad illuminare con sostanze elettrofluorescenti ed emettono fluorescenza.
Il DNA migra attraverso i pori del gel EF sttraverso due principi:
-carica (DNA -).
-peso molecolare, più è pesante più è lento a migrare.
Domande da interrogazione
- Qual è l'obiettivo principale della PCR?
- Quali sono i componenti essenziali per la PCR?
- Qual è il ruolo dei primer nella PCR?
- Come funziona il processo di elettroforesi degli acidi nucleici?
- Qual è l'importanza della temperatura durante i cicli di PCR?
L'obiettivo principale della PCR è amplificare il DNA, ottenendo molteplici copie di una regione target del DNA, replicando il fenomeno naturale della replicazione in vitro.
I componenti essenziali per la PCR includono DNA stampo, primer, TAQ polimerasi, dNTPs, buffer e magnesio, ognuno con un ruolo specifico nel processo di amplificazione del DNA.
I primer, che sono oligonucleotidi a singolo filamento, forniscono un innesco necessario per la TAQ polimerasi, permettendo l'appaiamento al DNA denaturato e garantendo la specificità della reazione.
L'elettroforesi separa frammenti di DNA e RNA per dimensione, poiché i frammenti più piccoli migrano più velocemente attraverso un gel di agarosio, sfruttando la carica negativa del DNA e il suo peso molecolare.
La temperatura è cruciale durante i cicli di PCR: la denaturazione avviene a 90/95 gradi, l'appaiamento a 55 gradi e l'allungamento a 72 gradi, garantendo il corretto funzionamento della TAQ polimerasi e l'efficacia dell'amplificazione del DNA.
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