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15. Saggi di sicurezza microbiologica

I prodotti farmaceutici, prima di entrare in commercio, devono rispondere a precisi limiti di contaminazione microbica. Tale valutazione viene effettuata sui singoli lotti produttivi.

I saggi effettuati servono per:

  • Controllare la sterilità del campione.
  • Controllare l’assenza di tossicità.
  • Controllare l’assenza di attività pirogena.
  • Verificare che il farmaco sia iniettabile.

Controllo di sterilità

È effettuato principalmente per tutti quei prodotti che devono essere sterili: farmaci iniettabili e destinati ad uso ospedaliero. L’analisi è eseguita nei laboratori in condizioni di asepsi, evitando qualunque contaminazione. Durante le varie procedure il prodotto non deve subire l’azione di agenti sterilizzanti, causa l’invalidità del test.

Il numero di campioni da prelevare varia a seconda del numero di lotti e a seconda della quantità di sostanza contenuta all’interno dei flaconi. Si definisce lotto un insieme omogeneo di recipienti che hanno subito una stessa preparazione. Il prelievo per il controllo della sterilità viene effettuato a caso:

Lotti Numero campioni Quantità campione Prelievo
<100 Min. 4 – 10% del lotto
100<x<500 10 lotti 1 mL Tutto il campione
>500 2% - Max. 20 lotti 20 mL 10% del contenuto

L’analisi si divide in due tipologie: metodo liquido e metodo solido. In entrambi i casi, come in tutti i saggi biologici, le prove sono effettuate in doppio.

Metodo liquido

Come terreno di analisi per la ricerca di funghi e batteri viene utilizzato un terreno liquido (brodo). A seconda della tipologia di batterio ricercato, dividiamo i terreni in:

MCO Terreno MCO riferimento
Aerobi Nutrient broth Stafilococco aureus
Anaerobi Tioglicolato di sodio Clostridium sphenoides
Funghi Sobouiaud Candida albicans

*: Serve come prova in bianco per vedere se il terreno è buono. Sapendo che quei m.o. crescono su quel terreno, la mancata crescita starebbe ad indicare che il terreno non è preparato in maniera adeguata.

Processo Accorgimenti
1. Preparazione provette: addizionare 5 mL di terreno. 10 mL batteri anaerobi. Il numero delle provette varia a seconda dei campioni. Per un singolo campione sono allestite 6 provette: 1+1 aerobi, 1+1 anaerobi e 1+1 funghi.
2. Preparazione provette prova: addizionare 5 mL di terreno. 10 mL batteri anaerobi. Allestite 3 provette contenenti i terreni + MCO riferimento.
3. Introduzione ceppo: la quantità di campione varia a seconda del campione in esame.
  • Le polveri sono disciolte prima dell’introduzione.
  • I liquidi sono immessi nel terreno direttamente.
  • I liquidi oleosi sono disciolti con solventi appropriati.
  • Se contengono conservanti o antibiotici, bisogna bloccarne l’attività.
4. Prova di fertilità: il ceppo di riferimento è cresciuto nel terreno. Se il terreno è buono si procede con l’incubazione.
5. Prova di sterilità del terreno. Provetta con solo terreno per verificare la sterilità del terreno; se limpida il campione non presenta tracce di MCO.
6. Incubazione: le provette sono messe ad incubare.
  • 48 h. a 30–37°C per i batteri.
  • 1 settimana a 25–30°C per i funghi.

59. Letture saggio

Ricerca MCO: ipotesi 1

Terreno + MCO Prove Terreno MCO aerobio MCO anaerobio MCO fungo Riferimento
1 ! ! ! ! ! !
2 ! ! ! ! ! !

L’analisi evidenzia l’assenza di m.o. all’interno del farmaco saggiato. L’analisi è da considerarsi NON valida poiché anche il test terreno + MCO riferimento ha dato esito negativo. Ciò significa che il terreno è stato preparato in maniera errata. Ripetere la procedura di analisi.

Ipotesi 2

Terreno + MCO Prove Terreno MCO aerobio MCO anaerobio MCO fungo Riferimento
1 ! ! ! ! ! !
2 ! ! ! ! ! !

L’analisi evidenzia la presenza di probabili m.o. aerobi e di funghi. Visto l’esito positivo di una sola delle due prove, l’intero test viene ripetuto, per verificarne la validità. Una successiva analisi potrebbe confermare la presenza dei m.o., o portare alla luce un’eventuale contaminazione avvenuta nella prima prova.

Ipotesi 3

Terreno + MCO Prove Terreno MCO aerobio MCO anaerobio MCO fungo Riferimento
1 ! ! ! ! ! !
2 ! ! ! ! ! !

L’analisi evidenzia la presenza di m.o. anaerobi. L’analisi è da considerarsi valida, poiché entrambe le prove hanno dato esito positivo e il test ha confermato la validità del terreno.

Ipotesi 4

Terreno + MCO Prove Terreno MCO aerobio MCO anaerobio MCO fungo Riferimento
1 ! ! ! ! ! !
2 ! ! ! ! ! !

L’analisi evidenzia la presenza di tutti i m.o. all’interno del farmaco saggiato. L’analisi è da considerarsi NON valida poiché anche il test terreno ha dato esito positivo. Ciò significa che il terreno è stato preparato in maniera errata. Ripetere la procedura di analisi.

*L’esito riportato riassume in generale l’andamento di tutti e tre i terreni + MCO riferimento.

Metodo solido

Procedimento introduttivo analogo a quello liquido. I terreni utilizzati sono agarizzati.

Processo Accorgimenti
1. Filtrazione campione: il campione liquido viene filtrato tramite filtro a caffettiera. Il passaggio del liquido attraverso il filtro, permette a quest’ultimo di trattenere sulla sua superficie gli eventuali m.o. presenti.
2. Preparazione inoculo: il filtro è tagliato in 3 parti. Ogni singolo pezzo è appoggiato con pinze sterili sul terreno.
3. Incubazione: le provette sono messe ad incubare.
  • 48 h. a 30–37°C per i batteri.
  • 1 settimana a 25–30°C per i funghi.

60. Letture saggio: ipotesi 1

Terreno + MCO Prove Terreno MCO aerobio MCO anaerobio MCO fungo Riferimento
1 ! ! ! ! ! !
2 ! ! ! ! ! !

L’analisi evidenzia l’assenza di m.o. all’interno del farmaco saggiato. L’analisi è da considerarsi valida poiché anche il test terreno + MCO riferimento ha dato esito positivo. Ciò significa che il terreno è stato preparato in maniera corretta.

Ipotesi 2

Terreno + MCO Prove Terreno MCO aerobio MCO anaerobio MCO fungo Riferimento
1 ! ! ! ! ! !
2 ! ! ! ! ! !

L’analisi evidenzia la presenza di probabili m.o. aerobi (crescita sul bordo) e di funghi (crescita di una sola prova). Visto l’esito positivo di una sola delle due prove, l’intero test viene ripetuto, per verificarne la validità. Una successiva analisi potrebbe confermare la presenza dei m.o., o portare alla luce un’eventuale contaminazione avvenuta nella prima prova.

Ipotesi 3

Terreno + MCO Prove Terreno MCO aerobio MCO anaerobio MCO fungo Riferimento
1 ! ! ! ! ! !
2 ! ! ! ! ! !

L’analisi evidenzia la presenza di m.o. anaerobi. L’analisi è da considerarsi valida, poiché entrambe le prove hanno dato esito positivo e il test ha confermato la validità del terreno.

Ipotesi 4

Terreno + MCO Prove Terreno MCO aerobio MCO anaerobio MCO fungo Riferimento
1 ! ! ! ! ! !
2 ! ! ! ! ! !

L’ultima ipotesi mette in luce i vari casi che si possono verificare: il test MCO aerobio ha dato esito positivo, ma la crescita di batteri al di fuori del disco fa pensare ad una contaminazione del terreno (il test va ripetuto). Il test MCO anaerobio presenta una prova nulla ed una con crescita lungo i bordi del filtro (il test va ripetuto). Il test MCO fungo presenta un test nullo ed uno positivo (il test va ripetuto). In un caso poco realistico come il seguente, l’utente deve provvedere a rifare nuovamente tutti i test. N.B. La contaminazione del terreno comporta un esito falso/positivo (il test va comunque ripetuto).

Assenza di tossicità

Valuta la presenza di sostanze tossiche all’interno del lotto. Si inietta la soluzione in esame, sciolta in soluzione salina, in un numero dispari di topolini. Il tempo dell’inoculo deve essere lento 15–30”. La tossicità del farmaco è stabilita se almeno uno dei topolini muore dopo 24 ore.

Saggio di iniettabilità

Attualmente poco utilizzato, serve per vedere se il farmaco è iniettabile.

61.

Il prodotto viene somministrato ad un porcellino d’India sulla schiena. Se l’animale presenta rossore nella zona di inoculo, danno locale o cambiamento di comportamento allora il farmaco non è iniettabile.

Assenza di attività pirogena

Il seguente test permette di verificare l’attività pirogena del farmaco. Una sostanza ha attività pirogena quando una volta iniettata all’interno del corpo provoca un aumento della temperatura corporea. Le sostanze con queste determinate caratteristiche sono quelle legate ai lipopolisaccaridi dei Gram -. Con questa prova si mette in evidenza la presenza di batteri Gram – (endotossina – Lipide A).

Il saggio era fatto sui conigli; se si verificava un aumento di temperatura la presenza dei LPS era confermata. Oggi giorno tale procedura non è più utilizzata ma viene utilizzato il LAL Test (vedi pag. 26 – effetto pirogeno).

Titolazione microbiologica di un antibiotico

L’industria farmaceutica che deve preparare confezioni di antibiotico da vendere, una volta comprata la materia prima in bidoni, deve definirne la potenza (attività). Nei flaconi o capsule non deve esserci una quantità di farmaco superiore o inferiore al 5% di quanto dichiarato (se la quantità è superiore, il rischio è che la terapia risulti sbagliata, se è inferiore si tratta di frode).

Metodo per valutare la potenza o attività.

Protocollo: si confronta la polvere con uno standard (esistono delle polveri internazionali standard dello stesso farmaco con potenza pari al 100% del peso). Effettuare 3 diluizioni ipotetiche del prodotto da saggiare come se valesse 100% e 3 diluizioni note dello standard. Eseguire un antibiogramma: misurare gli aloni d’inibizione dello standard e del prodotto da saggiare.

Esempio

Standard 12 mm; polvere ignota 10 mm.

Fare la proporzione 12:100% = 10:X. X = 83%.

La polvere ignota ha una potenza dell’83% (significa che in 100 mg di polvere solo 83 mg sono di principio attivo).

Se nei flaconi o nelle capsule devo mettere 400 mg di principio attivo (dose) farò un’altra proporzione:

400 mg:83% = X:100%. x=482 mg.

Devo pesare e mettere più antibiotico nel flacone o capsula per compensare la potenza più bassa.

Prima di commercializzare il prodotto bisogna verificare nuovamente la potenza. Ripetere l’antibiogramma come in precedenza, ma in questo caso bisogna ottenere esatta corrispondenza con lo standard a tutte le concentrazioni conside

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Scienze biologiche BIO/19 Microbiologia generale
I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Gibbs94 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia e microbiologia clinica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Università degli studi di Torino o del prof Mandras Narcisa.
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