Concetti Chiave
- Esistono diversi metodi per inserire plasmidi nelle cellule, come la trasformazione per batteri e la trasfezione per eucarioti.
- La permeabilità della membrana cellulare è fondamentale in tecniche come shock termico ed elettroporazione per facilitare l'ingresso del DNA plasmidico.
- Il bombardamento biolistico utilizza un sistema di proiettili di tungsteno per inserire plasmidi, comunemente impiegato nelle piante.
- La microiniezione è una tecnica diretta per inserire geni in cellule, utile per cellule staminali e embrionali.
- La selezione delle cellule che hanno incorporato il gene avviene attraverso geni reporter, in particolare quelli che conferiscono resistenza agli antibiotici.
Metodi di inserimento del plasmide
Ci sono diversi sistemi per inserire un plasmide in una cellula (trasformazione per la cellula batterica e trasfezione per la cellula eucariotica).
I primi due sistemi funzionano sulla variabilità della permeabilità della membrana. Nel primo caso si usano ioni positivi inseriti nella membrana in modo che il DNA del plasmide (carico negativamente gli si avvicini). Viene poi portata la temperatura a gradi basse e con questo shock termico improvviso la membrana diventa permeabile e gli enzimi entrano. L’elettroporazione consiste in un impulso elettrico che fa variare la permeabilità della membrana.
Nel metodo di bombardamento biolistico (con pistola bio-rad) il plasmide viene circondato con una membrana di tungsteno e viene sparato all’interno delle cellule. Si usano questi metalli perché inerti, che non reagiscono e non provocano reazioni. Questo tipo di inserimento si fa solitamente nelle piante.
La microiniezione serve per inserire dei geni nelle cellule, soprattutto quando si vuole agire su cellule staminali embrioni ecc.
Tecniche di selezione genetica
Una volta che le cellule sono state ottenute bisogna selezionare quelle che hanno inserito il gene. In alcuni casi l’introduzione non avviene. La selezione si fa con i geni reporter. Rispetto ad una tecnica basata sulla fluorescenza, i geni reporter con la resistenza per gli antibiotici, per certi tipi di utilizzo, sono utili perché sopravvivono.
Domande da interrogazione
- Quali sono i principali metodi per inserire un plasmide nelle cellule?
- Come funziona il metodo di elettroporazione per l'inserimento del plasmide?
- Qual è l'importanza dei geni reporter nella selezione genetica?
I metodi principali per inserire un plasmide includono la trasformazione per cellule batteriche e la trasfezione per cellule eucariotiche, utilizzando tecniche come shock termico, elettroporazione, bombardamento biolistico e microiniezione.
L'elettroporazione utilizza un impulso elettrico per aumentare la permeabilità della membrana cellulare, permettendo così al DNA del plasmide di entrare nella cellula.
I geni reporter, in particolare quelli che conferiscono resistenza agli antibiotici, sono fondamentali per selezionare le cellule che hanno integrato il gene, poiché permettono di identificare le cellule sopravvissute dopo l'introduzione del plasmide.
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