Concetti Chiave
- I marcatori di danno epatico vengono analizzati tramite tecniche spettrofotometriche, fondamentali in chimica clinica.
- Lo spettrofotometro utilizza lampade specifiche, un monocromatore, una cuvetta per il campione e un detector per misurare l'assorbanza.
- La legge di Lambert-Beer permette di calcolare la concentrazione di un analita attraverso la relazione A= εCi.
- Le misure spettrofotometriche possono essere utilizzate per analisi quantitative dirette e indirette, con particolare focus sulle reazioni enzimatiche.
- Il metodo colorimetrico per l'albumina prevede l'uso del verde di bromocresolo e l'assorbanza a 629 nm per determinare la concentrazione dell'albumina.
Tecniche spettrofotometriche in chimica clinica
I marcatori di danno epatico vengono analizzati mediante tecniche spettrofotometriche, che riguardano la maggior parte dei test in chimica clinica.
La spettrofotometria è una tecnica che prevede l’interazione tra radiazioni elettromagnetiche e la materia. Le radiazioni elettromagnetiche di interesse sono quelle che vanno da visibile (400-700nm) all’ultravioletto (10-400 nm).
Lo spettrofotometro è formato da :
una lampada a deuterio (se si lavora nell’UV) o al tungsteno (se si lavora nel visibile),
un monocromatore, un filtro che seleziona la lunghezza d’onda di interesse
una cuvetta che contiene il campione di plasma o di siero
un detector o fotomoltiplicatore, che trasforma il segnale luminoso in impulso elettrico
Legge di Lambert-Beer e applicazioni
L’indicazione che dà lo spettrofotometro è una misura dell’assorbanza, data dal logaritmo del rapporto tra l’intensità della radiazione incidente il campione e l’intensità della radiazione trasmessa dal campione. Attraverso poi la legge di Lambert-Beer
A= εCi
si può ricavare la concentrazione dell’analita di interesse.
ε è il coefficiente di estinzione molare, una costante caratteristica di ogni analita.
i rappresenta invece la lunghezza del cammino ottico, che per convenzione in tutto il mondo è uguale a 1, perché tutte le cuvette prodotte hanno un lato di 1 cm.
C è la concentrazione dell’analita.
Analisi quantitativa diretta e indiretta
Le misure spettrofotometriche in laboratorio vengono utilizzate per:
l’analisi quantitativa diretta (molto poco utilizzate);
l’analisi quantitativa indiretta, tramite reazioni enzimatiche o colorimetriche;
l’analisi della attività cinetica enzimatica;
Analisi quantitativa diretta
L’unica applicazione clinica è la misura della concentrazione e del grado di purezza del DNA e dell’RNA. I campioni di acidi nucleici vengono estratti dal settore di Biologia Molecolare e vengono indirizzati al Laboratorio Analisi. Qui lo spettrofotometro viene impostato ad una lunghezza d’onda di 260 nm per andare poi a misurare la concentrazione del DNA prima di effettuare le amplificazioni.
Metodo colorimetrico per l'albumina
Viene misurata in laboratorio con un metodo colorimetrico:
• il sangue viene inserito in una provetta e centrifugato, in modo da ottenere il plasma;
• il plasma si inserisce in un cuvetta e si aggiunge un colorante (verde di bromocresolo);
• viene acidificato il campione a pH 4.1: in queste condizioni il verde di bromocresolo forma un complesso con l’albumina che assorbe a 629 nm;
• viene impostato lo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 629 nm, che fornisce una misura di assorbanza che riferisce la concentrazione del complesso;
• dalla concentrazione del complesso si riesce a risalire alla concentrazione dell’albumina.
Si chiamano quindi “indirette” perché si misura la concentrazione del complesso albumina-verde di bromocresolo, e sapendo che agiscono in concentrazioni molari 1:1 si può risalire alla concentrazione dell’albumina.
Domande da interrogazione
- Qual è il principio fondamentale della spettrofotometria in chimica clinica?
- Come si calcola la concentrazione di un analita utilizzando la legge di Lambert-Beer?
- Quali sono le principali applicazioni delle misure spettrofotometriche in laboratorio?
- Come viene misurata l'albumina in laboratorio utilizzando un metodo colorimetrico?
La spettrofotometria si basa sull'interazione tra radiazioni elettromagnetiche e materia, misurando l'assorbanza, che è il logaritmo del rapporto tra l'intensità della radiazione incidente e quella trasmessa dal campione.
La concentrazione dell'analita si calcola tramite la formula A = εCi, dove A è l'assorbanza, ε è il coefficiente di estinzione molare, i è la lunghezza del cammino ottico e C è la concentrazione dell'analita.
Le misure spettrofotometriche vengono utilizzate per l'analisi quantitativa diretta, l'analisi quantitativa indiretta tramite reazioni enzimatiche o colorimetriche, e l'analisi dell'attività cinetica enzimatica.
L'albumina viene misurata aggiungendo un colorante al plasma e acidificando il campione, formando un complesso che assorbe a 629 nm. La concentrazione del complesso permette di risalire alla concentrazione dell'albumina.
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