Ingegneria genetica tesina

Quando la natura non basta: l’ingegneria genetica

2013/2014 L’ingegneria genetica è il processo artificiale condotto in vitro che permette la costruzione di DNA, per assemblaggio di frammenti di DNA o geni di diversa origine, e il suo funzionamento all’interno di una cellula.

Il DNA così prodotto viene chiamato DNA ricombinante o ibrido con sigla DNAr o rDNA.

Quando la natura non basta: l’ingegneria genetica

Cuomo Nicola 5B|BIO

Indice

• Biotecnologie: l’ingegneria genetica........................................Pg 2
• Impianti: regolazione dei processi chimici..................................Pg 18
• Chimica fisica: legami chimici................................................Pg 27
• Processi: petrolio........................................................................Pg 31
• Inglese: genetically modified food.............................................Pg 37
• Microbiologia: gli alimenti........................................................Pg 39
• Storia: la prima guerra mondiale................................................Pg 42
• Italiano: D’Annunzio.................................................................Pg 45 1

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Quando la natura non basta: l’ingegneria genetica

Biotecnologie: l’ingegneria genetica

La storia

Il primo fenomeno scoperto utilizzato dall’ingegneria genetica è stato quello della restrizione, in base al quale alcuni enzimi presenti nelle cellule batteriche distruggono il DNA virale, ma non quello della cellula stessa.

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I frammenti vengono tagliati in punti prestabiliti, i frammenti prodotti dallo stesso enzima sono tutti uguali.

In seguito furono isolati gli enzimi ligasi e la trascrittasi inversa e nel 1972 si scoprì che l’azione combinata di questi enzimi poteva portare alla creazione di un DNA ricombinante, questa tecnica fu chiamata tecnica del DNA ricombinante e può essere schematizzata in 5 fasi:

• Ricerca del gene
• Isolamento del gene
• Scelta del vettore
• Ricombinazione
• Riproduzione del DNAr

Questo processo finalizzato alla costruzione di un nuovo organismo, non più libero, ma ingegnerizzato in modo da “lavorare” per uno scopo.

Le fasi successive a quelle appena elencate sono:

• Coltivazione dell’organismo ricombinante
• Induzione alla produzione
• Produzione

Enzimi: restrizione, ligasi e trascrittasi inversa

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono enzimi ad azione specifica che tagliano il DNA, il taglio può essere non netto, che lascia estremità coesive, come nell’immagine dove il taglio A è effettuato dall’enzima Eco Rl mentre B dall’enzima Bam Hl: 3

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Oppure a taglio netto come nell’enzima Sma I (Serratia marcescens), che non lascia estremità coesive:

Gli enzimi di restrizione vengono indicati con una sigla, che deriva sia dagli organismi che li producono e sia dalle condizioni necessarie per isolarlo, ad esempio nella sigla EcoRI la “E” sta per Escherichia “co” sta per Coli ed I perché si tratta della prima endonucleasi isolata, di seguito è riportata una tabella con gli enzimi di restrizione più noti:

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Ligasi

Anche se i filamenti terminali sono complementari è necessario un enzima che li leghi per ripristinare le catene interrotte dall’enzima di restrizione.

Trascrittasi inversa

Questo enzima è stato scoperto in alcuni virus dove l’informazione non deriva dal DNA ma dall’RNA.

Quando il virus trasmette l’RNA insieme ad esso trasmette anche l’enzima della trascrittasi inversa che trasforma l’RNA in un filamento di DNA copia agendo in modo inverso a quello che normalmente avviene nella trascrizione diretta.

Di seguito è riportato il meccanismo nello specifico: 5

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Tecnica del DNA ricombinante

Per le produzioni che utilizzano la tecnica del DNA ricombinante il processo può essere così schematizzato:

• Ricerca del gene di interesse
• Estrazione del DNA
• Amplificazione del DNA
• Frammentazione, separazione e sequenziamento
• Scelta del vettore per il gene
• Inserimento del gene nel vettore
• Introduzione del DNAr nelle cellule ospiti
• Riproduzione o clonazione della cellula ricombinanti
• Coltivazione dell’organismo ricombinante
• Produzione

Ricerca del gene

Il gene di interesse viene ricercato nelle cellule specializzate per quella produzione anche se è presente in tutte le cellule dell’organismo, esso viene individuato nell’RNAm trascritto.

Separato l’RNAm, si procede con la trascrittasi inversa per produrre il gene corrispondente, il gene viene sequenziato per definire la successione dei nucleotidi ed avere una banca dati per le varie proteine.

Estrazione del DNA

Individuata la sequenza della proteina da ricercare, si passa ad estrarre il gene dalla cellula donatrice.

L’estrazione ora si fa con metodi sempre più veloci in maniera automatizzata.

Amplificazione del DNA

L’amplificazione del DNA avviene tramite la tecnica del PCR (reazione a catena della polimerasi) atta a formare numerose copie dal DNA di partenza, viene effettuata tramite l’enzima DNA-polimerasi.

Il frammento di DNA viene posto a miscela assieme con un oligonucleotide chiamato primer, la quantità necessaria dei 4 nucleotidi e la DNA polimerasi. 7

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La miscela viene riscaldata per separare i due filamenti di DNA, i primer vanno a legarsi alla parte di DNA complementare e l’enzima DNA-polimerasi copia il filamento di DNA.

Questa tecnica è vantaggiosa sia perché è un processo a catena sia perché il DNA ottenuto è l’esatta copia di quello originale.

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Frammentazione, separazione e sequenziamento

Il DNA viene sottoposto all’azione di diversi enzimi di restrizione in modo da ottenere frammenti diversi, per separarli vengono sottoposti all’azione elettroforetica su gel di agarosio.

A causa della presenza di gruppi fosfati il DNA ha carica – ed è attratto dalla carica +.

La migrazione sul gel in presenza di un campo elettrico è determinata dalla grandezza e quindi dalla massa del gene.

I filamenti così separati vengono trasferiti su un filtro di nitrocellulosa grazie ad un flusso di una soluzione tampone mantenendo le stesse posizioni, e quindi vengono ibridati con filamenti di DNA radioattivi (sonde radioattive), infine il filtro viene sottoposto all’azione di un rivelatore di radioattività che permette di identificare solo i filamenti coniugati con le sonde marcate radioattive.

Questa tecnica viene conosciuta con il nome di Southern blotting e può presentare delle varianti sull’identificazione dei filamenti di DNA, ad esempio con l’uso di sonde marcate con enzimi che danno una reazione colorata.

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Tecnica di differenziazione su gel di agarosio con sonde radioattive: 11

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Tecnica di differenziazione con l’uso di enzimi:

Scelta del vettore

Uno dei problemi dell’ingegneria genetica è la veicolazione del gene donatore nella cellula ospite, perciò si usano vettori di vario tipo come:

• Plasmidi
• Batteriofagi o virus batterici
• Cosmidi

Batteriofagi

Sono dei virus che attaccano cellule batteriche, il primo che è stato utilizzato è il fago λ che è specifico per l’E. Coli che rende più semplice la sua manipolazione.

Cosmide

Sono prodotti artificialmente per ibridazione tra un DNA virale ed un plasmide.

Plasmide

I plasmidi sono piccole molecole di DNA extracromosomico presenti nei procarioti.

I plasmidi sono i più utilizzati per la versatilità e la facilità di manipolazione.

I più utilizzati sono il pSC101 ed il pBR322 le lettere B ed R stanno per la capacità di resistere a particolari antibiotici, possono essere modificati per cambiare particolari caratteri come la velocità di riproduzione e la capacità di inserimento all’interno della cellula, 12

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Inoltre il plasmide non deve interferire con il metabolismo della cellula ospite nella produzione.

La cellula deve riconoscere i segnali di espressione del gene e deve resistere a sostanze estranee al proprio organismo.

Le cellule più utilizzate sono: E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces e Sacharomyces cerevisiae, le cellule possono contenere una sola molecola di DNA ricombinante.

Sintesi del DNAr

Occorrono i seguenti “materiali”:

• Gene donatore
• Vettore
• Enzimi di restrizione
• DNA ligasi

L’enzima di restrizione deve eseguire il taglio sia sul gene donatore e sia sul vettore per far sì che le due estremità siano coesive.

Per la complementarietà delle basi azotate, però questa coesione risulta molto debole ed è necessaria l’azione dell’enzima ligasi che forma legami covalenti tra i nucleotidi. 13

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A questo punto il complesso del DNAr deve entrare nella cellula ospite e attraversare la membrana plasmatica.

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Il meccanismo si chiama trasformazione se il vettore è il plasmide invece trasfezione se si tratta di un virus.

La cellula più utilizzata è l’Escherichia coli.

Clonazione e produzione del DNA ricombinante

L’espressione del DNAr, che coincide con la sostanza da produrre, deve essere esaltata al massimo perché il processo consegua alte rese: l’amplificazione dell’attività del DNAr si ottiene con la clonazione e, quindi, con la riproduzione del ceppo mutato.

Quando il vettore utilizzato è il plasmide esso si riproduce contemporaneamente alla cellula ma con ritmo più veloce.

Durante la coltivazione delle cellule possono verificarsi tre diverse situazioni come:

• La presenza del ceppo mutato contenente il gene-donatore
• La presenza del ceppo mutato contenente il plasmide originario
• La presenza del ceppo originario

Quindi è necessario separare questa miscela di organismi per ricavare solo il ceppo mutato.

La tecnica utilizzata è la replica planting, che consiste nella replicazione delle piastre mantenendo la stessa posizione delle colonie della piastra di partenza, si procede nel pressare del velluto liscio sul terreno da copiare in modo che il velluto “catturi” le colonie, poi lo stesso velluto si pressa su delle piastre vergini che saranno seminate mantenendo la posizione delle colonie della piastra originaria. 15

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Dopo la replica le colonie devono essere differenziate, la differenziazione si basa sulle proprietà del plasmide.

Ad esempio il pBR322 nella sua struttura presenta la resistenza a due antibiotici l’ampicillina e la tetraciclina, è stato osservato che l’enzima di restrizione Bam HI taglia il gene della tetraciclina quindi si ha la formazione dei seguenti ceppi:

• Ceppo che contiene il pBR322 che al posto del gene della tetraciclina presenta il gene donatore
• Ceppo con il plasmide pBR322 originario
• Ceppo originario

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Per differenziare le colonie si eseguono semine su terreni contenenti gli antibiotici, la prima semina si fa su un terreno contenente l’ampicillina, su questo rimarranno solo i ceppi mutati, la seconda semina si fa su un terreno contenente tetraciclina e ampicillina, su questo terreno rimarranno solo i ceppi in possesso del plasmide originario, la posizione delle colonie permette di identificarle ed isolare le colonie volute. 17

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Produzione e raccolta

Per ottimizzare la produzione:

• La cellula ospite possa esprimere il gene estraneo
• L’espressione deve essere la massima possibile
• La raccolta del prodotto deve essere relativamente semplice

Il microrganismo viene messo in bioreattori sterili dove vengono controllate tutte le variabili possibili come pH, temperatura ecc. per assicurare la massima produzione possibile in coltura discontinua e evitare inquinamento e mutazioni genetiche.

La resa dell’impianto si attesta intorno al 20% ma attualmente è possibile spingerla attorno al 50%, si deve tenere presente che la produzione della proteina voluta invalida il metabolismo della cellula e che quindi si deve trovare un compromesso tra la produzione e il metabolismo.

La posizione della proteina all’interno della cellula può essere sia interna e sia esterna alla cellula facendo sorgere diversi problemi, se la proteina è localizzata nel citoplasma si trova complessata con le altre proteine cellulari rendendo difficile l’estrazione, in questo caso si devono trovare delle soluzioni di tipo biochimico tramite l’uso di carrier che provvedono a far fuoriuscire la proteina dalla cellula per poi estrarla in base a particolari caratteristiche chimico-fisiche (filtrazione, elettroforesi, cromatografia).

Di seguito è riportata la procedura di separazione tramite l’uso dei carrier:

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Più semplice risulta l’estrazione all’esterno della cellula, in questo caso un enzima adatto provvede a separare ed attivare le funzioni della proteina.

Somatotropina (GH o HGH)

È un ormone polipeptidico che viene secreto dall’ipofisi, regola l’accrescimento di alcuni tessuti e in modo specifico delle ossa lunghe, una sua eccedenza nel periodo dello sviluppo porta al gigantismo ipofisario mentre una deficienza porta al nanismo ipofisario, invece nella fase postpuberale un’eccessiva produzione determina l’acromegalia (deformazioni ossee e tissutali).

La composizione dell’ormone varia da specie a specie quindi questo comporta difficoltà di estrazione, con altri ormoni invece si poteva utilizzare un equivalente animale come con l’insulina che però poteva portare a diversi problemi di allergia.

Attualmente la produzione avviene in parte per via biotecnologica con batteri ingegnerizzati ed in parte viene sintetizzato chimicamente.

Struttura dell’ormone:

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Impianti: regolatori

Regolazione dei processi chimici

Per assicurare un buon funzionamento di un impianto sia chimico che microbiologico (bioreattori) bisogna utilizzare un sistema di controllo e di regolazione al fine di aumentare le rese e assicurare la sicurezza