Fisiologia- Trasporto attraverso le membrane

Trasporto di sostanze attraverso la membrana cellulare

Il liquido extracellulare contiene molto Na e poco K e anche molto Cl, mentre si ha il contrario nel liquido intracellulare. La concentrazione di fosfati delle proteine è superiore nel liquido intracellulare. La membrana cellulare è costituita da un doppio strato fosfolipidico che non è miscibile né con il liquido extracellulare né con quello intracellulare e quindi funge da barriera al passaggio delle molecole di acqua e delle sostanze idrosolubili tra i due compartimenti liquidi. Alcune sostanze però possono penetrare questo strato fosfolipidico (sostanze lipofile) per entrare o uscire dalla cellula passando direttamente attraverso la matrice lipidica stessa della membrana.

Le molecole proteiche della membrana sono caratterizzate da proprietà di trasporto completamente differenti e interrompono la continuità del doppio strato fosfolipidico, rappresentando una via alternativa di passaggio attraverso la membrana cellulare. Svolgono quindi la funzione di proteine di trasporto. Tra queste ci sono le proteine canale che contengono spazi acquosi che si estendono attraverso tutta la molecola permettendo il libero movimento di ioni o molecole e abbiamo anche le proteine trasportatrici (carrier) che si combinano prima con le sostanze destinate ad essere trasportate e poi mediante modificazioni conformazionali della struttura proteica, operano il trasferimento di queste sostanze negli interstizi della proteina stessa verso l’altro lato della membrana. Le proteine di trasporto sono entrambe selettive nei confronti del tipo o dei tipi di molecole o ioni ai quali consentono il passaggio attraverso la membrana.

Il passaggio di ioni o molecole attraverso la membrana cellulare, sia direttamente attraverso il doppio strato fosfolipidico, sia attraverso le proteine avviene secondo due meccanismi fondamentali: diffusione (movimento molecolare del tutto casuale sia attraverso spazi intermolecolari della membrana sia in combinazione con proteine trasportatrici. L’energia per la diffusione è l’energia cinetica della materiale) e trasporto attivo (movimento di ioni o di altre sostanze attraverso la membrana in combinazione con una proteina trasportatrice che fa muovere le sostanze contro un gradiente di concentrazione a un livello più alto. Questo richiede un apporto energetico addizionale, oltre all’energia cinetica posseduta dalle molecole della sostanza).

Diffusione

Nei liquidi dell’organismo tutti gli ioni e le molecole dell’acqua e delle sostanze in soluzione sono in costante movimento; ogni particella si muove seguendo una sua propria direzione. Il movimento di queste particelle viene definito calore e tale movimento non si arresta mai, eccetto alla temperatura corrispondente allo zero assoluto. Maggiore è il movimento maggiore sarà la temperatura. Quando una molecola A, in movimento si avvicina ad una molecola B, stazionaria, le forze elettrostatiche e le forze nucleari della molecola A respingono la molecola B, trasferendole parte della propria energia cinetica. La molecola B di conseguenza acquisisce energia cinetica e accelera il suo movimento, mentre la molecola A perde parte della propria energia cinetica e rallenta il suo movimento. Nella figura 4.3 una molecola in soluzione va rimbalzando tra le altre molecole nelle varie direzioni spostandosi a caso. Questo continuo movimento molecolare nei liquidi e nei gas si definisce diffusione. Le particelle colloidali diffondono a una velocità minore a causa delle maggiori dimensioni rispetto alle molecole e agli ioni.

Diffusione attraverso la membrana cellulare

Può avvenire mediante due processi che sono la diffusione semplice e la diffusione facilitata. La diffusione semplice è il movimento di molecole o di ioni attraverso un’apertura della membrana o spazi intermolecolari, senza alcuna interazione con proteine trasportatrici presenti nella membrana stessa. La velocità di diffusione è determinata dalla quantità di sostanza disponibile, dalla velocità di movimento e dal numero e dalle dimensioni delle aperture nella membrana cellulare attraverso le quali le molecole o gli ioni possono muoversi. La diffusione semplice di una sostanza può avvenire attraverso gli interstizi del doppio strato lipidico se è una sostanza liposolubile e attraverso canali acquosi che si trovano all’interno di alcune grandi proteine di trasporto.

La diffusione facilitata richiede l’interazione con una proteina, che agevola il passaggio delle molecole o degli ioni attraverso la membrana, combinandosi chimicamente con essi e trasferendoli sotto questa forma attraverso la membrana.

Diffusione di sostanze liposolubili attraverso il doppio strato fosfolipidico

Uno dei fattori più importanti che determina la rapidità di diffusione di una sostanza attraverso il doppio strato fosfolipidico è la liposolubilità della sostanza stessa. L’ossigeno, l’azoto, l’anidride carbonica e gli alcol sono molto solubili e possono sciogliersi direttamente nel doppio strato fosfolipidico e passare attraverso la membrana cellulare attraverso una diffusione, esattamente come si verifica quando due soluti idrosolubili diffondono in soluzione acquosa. La velocità di diffusione è direttamente proporzionale alla loro liposolubilità. L’ossigeno attraversa la membrana in questo modo in quantità molto elevate, affluendo facilmente all’interno della cellula.

Diffusione dell’acqua e di altre molecole non liposolubili attraverso i canali proteici

L’acqua non è solubile nei lipidi di membrana, ma passa molto bene attraverso canali proteici che penetrano l’intero spessore della membrana. Molte delle membrane dell’organismo contengono pori costituiti da proteine dette “acquaporine”, che permettono il passaggio rapido e selettivo dell’acqua attraverso la membrana. Le acquaporine sono altamente specializzate e nei mammiferi ne esistono 13 tipi differenti caratterizzate da uno stretto diametro che permette alle molecole di acqua di diffondere attraverso la membrana una alla volta. Il poro è invece troppo piccolo per il passaggio degli ioni idratati. La densità di alcune acquaporine, ad esempio l’acquaporina2, nelle membrane cellulari non è stabile ma varia in base alle condizioni fisiologiche. La quantità totale di acqua che diffonde in un secondo attraverso la membrana di un globulo rosso è pari a 100 volte il volume del globulo rosso stesso.

Altre molecole insolubili nei lipidi possono attraversare il doppio strato lipidico come l’acqua se sono sufficientemente piccole. Con l’aumentare delle dimensioni molecolari la capacità di penetrazione diminuisce molto. Ad esempio, il diametro dell’urea è maggiore di quello dell’acqua di circa il 20% ed ha una capacità di penetrare attraverso i pori delle membrane di circa 1000 volte inferiore. In ogni caso l’urea passa comunque rapidamente.

I pori sono costituiti da proteine integrali della membrana cellulare che formano, attraverso la membrana cellulare, dei tubi sempre aperti. Sono comunque dotati di una certa selettività in quanto, in base al proprio diametro e alla propria carica elettrica, consentono il passaggio soltanto di determinate molecole. I pori proteici che prendono il nome di acquaporine o canali per l’acqua consentono il rapido passaggio attraverso la membrana cellulare di molecole di acqua, ma non di altre molecole.

Diffusione attraverso i canali proteici

Si tratta di vie di comunicazione a forma di tubi che collegano il fluido extracellulare con quello intracellulare. Le sostanze si possono muovere per diffusione semplice attraverso questi pori e canali da una parte all’altra della membrana. I canali proteici sono selettivamente permeabili a diverse sostanze e molti di essi possono essere aperti o chiusi mediante porte regolate da segnali elettrici (canali voltaggio dipendenti) o sostanze chimiche che si legano alle proteine canale (canali ligando-dipendenti).

Permeabilità selettiva dei canali proteici

I canali proteici sono altamente selettivi per il trasporto di uno o più ioni o molecole. Questa selettività è dovuta alle caratteristiche del canale, quali diametro, forma e natura delle cariche elettriche e dei legami chimici disposti lungo le pareti interne.

I canali del potassio consentono il passaggio degli ioni K con una rapidità di circa 1000 volte maggiore rispetto al passaggio degli ioni Na anche se gli ioni K sono più grandi degli ioni Na. Ciò è dovuto al fatto che questi canali sono dotati di una struttura tetramerica composta da 4 subunità proteiche disposte attorno ad un poro centrale. Ogni subunità è dotata di 2 eliche transmembrana. La parte del poro del canale rivolta verso l’esterno è formata da anse rivestite internamente da atomi di ossigeno carbonilico che costituiscono un filtro selettivo poiché sono siti di legame temporaneo di ioni potassio idratati. Quando questi ioni entrano nel filtro selettivo, interagiscono con l’ossigeno carbonilico rilasciando la maggior parte di molecole di acqua ad essi legati e permettendo il passaggio degli ioni disidratati attraverso il canale. Gli atomi di ossigeno carbonilico sono troppo distanti tra loro per interagire con gli ioni sodio che sono più piccoli e che quindi non possono passare attraverso il filtro selettivo del poro. È proprio la presenza di diversi filtri selettivi a consentire il passaggio di ioni.

I canali del sodio hanno una sezione trasversale di soli 0,3-0,5 nm, ma la sua superficie interna è rivestita da amminoacidi dotati di una forte carica elettrica negativa: questa può trascinare all’interno dei canali piccole molecole di sodio disidratate, separandoli dalle molecole di acqua che normalmente li idratano. Una volta attratti gli ioni sodio possono diffondere in entrambe le direzioni. Anche questo canale è molto selettivo.

Meccanismi di apertura e chiusura delle porte dei canali proteici

Questi meccanismi di apertura e di chiusura consentono il controllo della permeabilità dei canali. Queste porte possono chiudersi sull’imboccatura del canale oppure sollevarsi da essa per effetto di una variazione conformazionale che modifica la forma della molecola proteica. Possiamo distinguere:

• Porte voltaggio-dipendenti (voltage gating): la conformazione della porta o i suoi legami chimici variano al variare del potenziale elettrico transmembrana. Una forte negatività sulla faccia interna della membrana può mantenere le porte esterne dei canali del sodio fermamente chiuse; quando all’interno della membrana si riduce la carica negativa, le porte possono aprirsi improvvisamente lasciando entrare il Na. Questo sta all’origine dei potenziali d’azione nelle fibre nervose, responsabili dei segnali nervosi. Le porte si trovano nella parte intracellulare dei canali del potassio, si aprono quando la parte interna della membrana cellulare assume una carica positiva. L’apertura di queste porte è una delle cause della conclusione del potenziale di azione;
• A controllo chimico o a ligando dipendenti (chemical porte gating o ligand gating): le porte dei canali proteici si aprono per effetto della combinazione di una sostanza chimica (ligando) con la proteina canale, combinazione che causa una modifica della conformazione o dei legami chimici della molecola proteica determinando così l’apertura o la chiusura della porta. Un esempio è l’acetilcolina sui canali dell’acetilcolina. Questa apre la porta del canale, rendendo permeabile un poro di circa 0,65 nm di diametro con carica negativa che permette il passaggio di tutte le molecole senza carica elettrica e degli ioni positivi di diametro inferiore a quelli del canale. Questa porta è molto importante nella trasmissione di segnali da un neurone ad un altro e dai neuroni alle fibre muscolari per determinare la contrazione.

Stato di apertura e stato di chiusura delle porte dei canali

In figura sono mostrate due registrazioni del flusso di corrente attraverso un canale del Na per un gradiente di potenziale di circa 25mV tra un versante e l’altro della membrana cellulare. La porta del canale si apre e si chiude di scatto e il canale può rimanere aperto per un tempo variabile da una frazione a parecchi millisecondi. Le modificazioni si verificano quindi con estrema rapidità. Ad un determinato potenziale il canale può restare sempre o quasi sempre aperto mentre ad un altro può restare sempre o quasi sempre chiuso. A voltaggi intermedi i canali tendono ad aprirsi e a chiudersi a intermittenza dando luogo ad un flusso intermedio medio di corrente di intensità compresa tra il minimo ed il massimo.

Metodo del “patch-clamp” per la registrazione del flusso di corrente ionica

È un metodo per la registrazione del flusso di corrente ionica attraverso i singoli canali. Una micropipetta con una punta di 1-2 µm viene appoggiata sul lato esterno della membrana. Si esercita un’aspirazione all’interno della pipetta in modo da attrarre leggermente la membrana all’interno della punta della micropipetta e può essere registrato il flusso di corrente attraverso la minuscola porzione di membrana che si trova sotto la punta. La piccola porzione di membrana può anche essere rimossa e posta in una soluzione mantenendola aderente alla punta della micropipetta. Ciò permette di variare a piacimento la concentrazione degli ioni sia nella soluzione interna della pipetta che in quella esterna. Anche il voltaggio può essere impostato ad un valore (clamped). In questo modo si può studiare una singola proteina canale usando porzioni di membrana sufficientemente piccole. Variando la concentrazione degli ioni e il voltaggio ai due lati della membrana è possibile determinare le caratteristiche di diffusione degli ioni nel singolo canale isolato e anche le modalità di apertura e di chiusura delle porte.

Diffusione facilitata richiede proteine trasportatrici di membrana

La diffusione facilitata viene anche definita diffusione mediata da un trasportatore in quanto una sostanza trasportata secondo questa modalità diffonde attraverso la membrana per azione di una specifica proteina trasportatrice che facilita la diffusione della sostanza da un lato all’altro della membrana. La velocità di diffusione attraverso un canale aperto aumenta proporzionalmente alla concentrazione della sostanza che diffonde mentre la velocità della diffusione facilitata tende verso un valore massimo (V_max). All’aumentare della concentrazione della sostanza la velocità di diffusione in un canale continua ad aumentare proporzionalmente mentre nella diffusione facilitata non può superare il limite rappresentato dalla V_max.