Fisiologia dei sistemi

Fisiologia dei sistemi

Università degli studi di Teramo

Biotecnologie – Capitolo 1

Introduzione alle colture cellulari

Abbiamo bisogno di colture di cellule, o tessuti, per superare problemi nello studio del comportamento cellulare come:

• Variazioni che si presentano in animali in stato di stress
• Effetti sui tessuti circostanti
• Produzione su larga scala di: vaccini, antibiotici, ormoni della crescita, insulina

Le colture cellulari possono essere utilizzate per diversi scopi oltre a quello di studi sulla tossicità:

• Le cellule coltivate in vitro possono fungere da materiale di partenza per l'estrazione di acidi nucleici o proteine
• Le cellule possono essere utilizzate per studi funzionali o di regolazione
• Le cellule possono essere utilizzate nella rigenerazione di tessuti e organi

Applicazioni delle colture

Saggi di applicazione delle colture cellulari:

• Prodotti cellulari: proteomica, molecole secrete, biotecnologia, creazione di bioreattori, raccolta di prodotti a valle
• Immunologia: epitopi di superficie, ibridomi, citochine e molecole di segnale
• Genomica: analisi genica, trasferimento, senescenza
• Ingegneria di tessuti: matrici e tessuti di sostegno, costrutti tissutali, ricerca su cellule staminali, propagazione, differenziamento
• Interazione tra cellule: morfogenesi, controllo paracrino, cinetica della proliferazione cellulare, cooperazione metabolica, adesione cellulare e motilità, interazione tra matrici
• Farmacologia: azione dei farmaci, interazione ligando recettore, metabolismo cellulare del farmaco, resistenza ai farmaci
• Attività intracellulare: trascrizione del DNA, sintesi delle proteine, metabolismo energetico, metabolismo dei farmaci, ciclo cellulare, differenziazione, apoptosi dell'RNA
• Flusso intracellulare: processamento recettori degli ormoni, flusso dei metaboliti, metabolizzazione del calcio, trasduzione del segnale

Storia delle colture

Nel 1885 Wilhelm Roux conservò il tessuto embrionale di pollo in una soluzione salina tiepida per alcuni giorni, creando le basi della tecnica delle colture cellulari. Nel 1907, Ross Harrison sviluppò la coltura cellulare di tessuto di rana. Scelse la rana per due motivi: essendo un animale a sangue freddo non richiede incubazione e la rigenerazione cellulare è molto veloce.

Alla fine degli anni '40 e all'inizio degli anni '50, ci fu un grande sviluppo della tecnica della coltura cellulare, in parte per supportare la ricerca virologica per la massiva produzione di vaccini. Nel 1949 Alan Parks sviluppò un protocollo per la crioconservazione. La famosa linea cellulare HeLa cells derivante da cellule tumorali cervicali fu estratta da una paziente malata di cancro che morì poco dopo. Grazie a questa linea cellulare si scoprì che le cellule tumorali possono dare vita ad altre cellule in modo continuo. Nel 1995 Eagle creò il medium di coltura BME sostituito poco dopo dal MEM.

Vantaggi e svantaggi della coltura cellulare

Vantaggi

• Attraverso l'incubatore possiamo gestire noi determinati parametri fisiologici che rimarranno tali nel tempo
• Si riesce subito ad individuare se vi è un effetto positivo o negativo di determinati elementi; quell’effetto si può inoltre capire se è reversibile o meno togliendo quella sostanza dal terreno
• Ha costi più bassi rispetto a una coltivazione in vivo operata attraverso sperimentazioni condotte su animali
• Sono facilmente riproducibili

Svantaggi

• Richiedono tanta esperienza
• Danno informazioni incomplete sul comportamento delle cellule perché ovviamente non si riuscirà mai a riprodurre in vitro ciò che accade nell'organismo; quest’ultimo infatti influenza le cellule attraverso il sistema endocrino, nervoso
• Il terreno di coltura può contenere elementi che inibiscono la proliferazione cellulare
• Non consentono lo studio di tossicità croniche (→ effetti negativi che durano nel tempo) perché le cellule in vitro durano alcuni giorni
• Alcune cellule possono modificarsi
• Il siero può veicolare contaminazioni animali

Tipologie di colture cellulari

Colture primarie: Preparate direttamente da un tessuto, possono essere disgregate dal tessuto d’origine mediante tecniche meccaniche, con digestione enzimatica o mediante la crescita delle cellule migranti da un espianto. Un tessuto di derivazione embrionale rispetto a quelli derivati da organismi adulti si disgregano più facilmente ma forniscono un maggior numero di cellule vive e proliferano più rapidamente. Le cellule isolate da un qualsiasi tessuto animale sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro (circa 50), dopo vanno incontro a degenerazione e morte, indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita e si indica come senescenza.

Sub colture (passaggio delle cellule): Vengono allestite per ottenere linee cellulari omogenee in quanto la coltura primaria si presenta eterogenea. Viene effettuata anche quando le cellule di una coltura vanno a confluenza.

Linea cellulare: Viene creata una subcultura da una linea cellulare primaria; essa diviene quindi una linea cellulare. Questo termine implica la presenza di numerosi lignaggi cellulari di fenotipo simile o distinto. Hanno una vita limitata di circa tre cicli di divisione. È essenziale stabilire una banca di “Master and Working” per mantenere le linee cellulari per un lungo periodo e per mantenere una grande quantità di cellule per un uso prolungato.

Linee cellulari continue: Derivano da singole cellule in cui mutazioni spontanee o indotte (es. da radiazione, virus, eventi genetici, sostanze chimiche) hanno annullato il programma genetico della senescenza. Si dicono perciò immortali: proliferano in modo continuo in presenza degli opportuni metaboliti. Molte linee cellulari continue sono state ottenute a partire da tessuti tumorali (es. HeLa). Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose: sono immortali, proliferano in vitro fino a raggiungere una densità maggiore delle cellule normali e, spesso, crescono senza legarsi ad alcuna superficie. Per ottenere linee cellulari trasformate si ricorre a mezzi chimici o a virus che inducono il tumore. Esse necessitano, inoltre, di minore quantità di siero e sono facilmente mantenute in semplici medium di coltura. La comparsa di una linea cellulare continua è generalmente contrassegnata da un’alterazione della citomorfologia (dimensioni delle cellule, rotondità, aderenza), un aumento dell’eteroploidia (variazione cromosomica tra le cellule), aneuploidia (divergenza rispetto al cariotipo del donatore euploide) e una perdita di marcatori specifici per tessuto.

Sistemi delle cellule in coltura

Le cellule possono essere coltivate principalmente in due modi:

• Coltura in monostrato: Le cellule che fanno parte di tessuti solidi (polmoni, epiteli, fibroblasti) crescono in vitro in adesione alla superficie delle piastre da coltura.
• Colture di cellule aderenti: Le cellule aderenti sono ancoraggio dipendenti e solitamente si propagano come un monostrato attaccato al substrato. L'ancoraggio è essenziale per la proliferazione. Le cellule aderenti smettono di proliferare una volta che diventano confluenti (cioè, quando ricoprono completamente la superficie del substrato), tale fenomeno è noto come inibizione da contatto. In tal caso si provvederà a fare una sub coltura.
• Coltura in sospensione: Crescono in sospensione e si moltiplicano in vitro senza aderire, tale fenomeno è noto come indipendenza da ancoraggio. Le cellule emopoietiche (derivate da sangue, milza o midollo osseo) nonché alcune linee cellulari trasformate e le cellule derivate da tumori maligni possono crescere in sospensione. Esse sono più facili da spostare in quanto non è necessario staccarle; infatti, quando le cellule di sospensione raggiungono la confluenza, bisogna rimuovere asetticamente un terzo del terreno di coltura e aggiungerne uno nuovo.

Sulla base della morfologia (forma e aspetto) o sulle loro caratteristiche funzionali, le cellule sono divise in quattro gruppi:

• Cellule simili ai fibroblasti (fibroblast like): attaccate a un substrato appaiono allungate e con due poli distinguibili
• Cellule simili a quelle epiteliali (epithelial like): sono coese al substrato e appaiono schiacciate e di forma poligonale
• Cellule simili ai linfoblasti (lymphoblast like): rimangono in sospensione e hanno forma sferica
• Cellule simili a quelle neuronali (neuronal like): sono coese al substrato e appaiono allungate a forma di pinna

Fasi della crescita cellulare

Fase lag (fase di ritardo)

In questa fase le cellule non si dividono. Durante questo periodo le cellule si adattano alle condizioni di coltura; la durata di questa fase dipenderà dalla fase di crescita della linea cellulare al momento della subcoltura e anche dalla densità di semina.

Fase logaritmica (fase di crescita)

Le cellule proliferano attivamente e si verifica un aumento esponenziale della densità cellulare. In questa fase la popolazione cellulare è considerata la più vitale (in quanto proliferazione, quindi numero di cicli cellulari). Ogni linea cellulare mostrerà diverse cinetiche di proliferazione cellulare durante la fase log. Durante questa fase è possibile determinare il tempo di raddoppio della popolazione.

Fase plateau (fase stazionaria)

La proliferazione cellulare rallenta a causa della confluenza della popolazione cellulare. È a questo stadio che il numero di cellule nel ciclo cellulare attivo scende allo 0-10% e le cellule sono più suscettibili alle lesioni.

Fase di declino (morte cellulare)

Vi è una riduzione del numero di cellule vitali. La morte cellulare non è dovuta alla riduzione degli integratori nutrizionali ma al percorso naturale del ciclo cellulare (senescenza).

L'adesione: fattori che interessano l'adesione cellulare

L’adesione è molto importante per la proliferazione e la differenziazione cellulare. Essa è resa possibile mediante proteine del citoscheletro. Tuttavia, in base all'adesione, vengono coinvolte diverse proteine:

• Interazione cellula-cellula: le principali proteine sono CAM e caderine. L’interazione è favorita anche da Gap junctions.
• Interazione cellula-matrice: le principali proteine sono integrine e proteoglicani transmembrana.

In coltura l’adesione viene bloccata mediante trattamento con tripsina. I fattori che permettono la crescita cellulare in vitro sono:

• Cellule appropriate
• Terreno di coltura adatto
• Scelta del terreno in base alla cellula (liquido o solido)
• Controllo dei gas (CO₂, Ossigeno)
• Temperatura
• Sterilità

Capitolo 2: Strumentazione da laboratorio

In un laboratorio di colture cellulari sarebbe opportuno:

• Allestire stanze che sono facili da pulire
• Avere un sistema di filtrazione dell'aria
• Avere stanze separate per: separare le colture cellulari, preparare medium/soluzioni e materiale biologico
• Avere la lavanderia e l’area per la sterilizzazione
• Non avere laboratori di microbiologia, stabulari e stalle vicino ai laboratori di colture cellulari

L’area del laboratorio dove si effettuano unicamente le colture cellulari è sterile. Qui non deve esserci traffico di persone e/o altri fattori che possano favorire le contaminazioni. In questa area è consigliabile:

• Avere piani di lavoro di colore chiaro per favorire l’osservazione delle colture (ed eventuali contaminazioni o cambi di pH)
• Avere una cappa a flusso laminare e uno spazio provvisto di cell counter e microscopio invertito

L’area di contenimento (o quarantena) è appunto asettica in cui si lavora con le linee cellulari e biopsie appena arrivate nel laboratorio. Prima di introdurle nell’area asettica è necessario verificare che il nuovo materiale biologico sia privo di qualsiasi contaminazione. L’area per incubatori è la zona dedita appunto all'incubazione cellulare. Le incubazioni dovrebbero essere portate avanti da incubatori distinti o in una stanza a temperatura controllata; questo in quanto bisogna soddisfare diversi parametri (CO₂, Ossigeno, Temperatura, ecc.) per ogni linea cellulare che si sta studiando. Se vengono utilizzati due o più incubatori è conveniente avere una stanza calda provvista di un apposito sistema di riscaldamento, circolazione dell’aria, un termostato e un registratore di temperatura.

Tecniche per mantenere asettico l'ambiente

• Controllare l’aria mediante traffico e flusso
• Sterilizzare mezzi e reagenti
• Evitare la contaminazione aerea delle soluzioni
• Evitare la contaminazione manuale delle apparecchiature
• Evitare l’apertura ripetuta delle bottiglie
• Tamponare tutti i tappi e i colli delle bottiglie con etanolo al 70%
• Irradiare l’incubatore con UV prima e dopo
• Flambare i colli delle bottiglie e le pipette passandoli rapidamente sulla parte più calda della fiamma
• Evitare di lasciare pipette e tappi sul bancone, esercitarsi a tenere in mano più cose usando tutte le dita
• Lavorare da sinistra a destra o viceversa, in modo che tutto il materiale finito si accumuli esclusivamente da un lato
• Pulire immediatamente le perdite e lasciare sempre il posto di lavoro pulito e ordinato
• Indossare il camice solo in laboratorio
• Indossare i guanti
• Non toccare nulla dopo aver toccato il terreno di coltura
• Tenere la pipetta dall’impugnatura

Strumentazione da laboratorio

Nella maggior parte dei laboratori di colture cellulari vengono utilizzate cappe a flusso laminare. Il vantaggio principale è che l’ambiente è protetto da polvere e contaminazione mediante un flusso costante e stabile di aria filtrata. Esistono due tipi di cappe a flusso laminare:

• Cappa a flusso laminare verticale: Offrono maggiore protezione agli operatori. L’aria dell’operatore circolerà in maniera verticale e creerà con il respiro una sorta di barriera tra esso e il campione.
• Cappa a flusso laminare orizzontale: Offre un flusso più stabile e la migliore protezione sterile alla coltura e ai reagenti.

Le attrezzature da incubazione o incubatori, invece, devono mantenere costante una temperatura compresa tra i 25-30° e 37° per le cellule provenienti da mammiferi. Esistono tre classi di incubatori:

• Classe I: Offrono significativi livelli di protezione per il personale di laboratorio e l’ambiente se utilizzate con buone tecniche microbiologiche; ma non forniscono protezione alle colture dalle contaminazioni. Sono simili nel design e nelle caratteristiche del flusso d’aria alle cappe chimiche.
• Classe II: Sono progettate per il lavoro che coinvolge materiali pericolosi e forniscono anche un ambiente asettico necessario per gli esperimenti di coltura cellulare. Un armadio di biosicurezza di classe II dovrebbe essere utilizzato per la manipolazione di materiali potenzialmente pericolosi (Esempio: colture derivate da primati, colture viralmente infette, radioisotopi, reagenti cancerogeni o tossici).
• Classe III: Gli armadi per biosicurezza sono a tenuta di gas e offrono il massimo livello possibile di protezione per il personale e l’ambiente. Per i lavori che manipolano patogeni umani noti e altri materiali molto pericolosi è necessario un armadio di biosicurezza di classe III.

Gli incubatori di CO₂ devono solitamente mantenere una percentuale di CO₂ di circa il 5%. Alcuni contenitori, come piastre di Petri o piastre a più pozzetti, richiedono un’atmosfera controllata (95% di aria) con elevata umidità (99% umidità) ed elevata tensione di CO₂. Gli incubatori, quindi, dovrebbero essere abbastanza spaziosi, avere un controllo di temperatura, ossigeno e CO₂, essere facilmente pulibili, essere costituiti da materiali non ossidabili ed essere puliti almeno ogni due mesi. Ci sono due tipi di incubatori:

• Incubatrice a secco (più economica): Le cellule devono essere coltivate in boccette chiuse (flask) per evitare l’evaporazione
• Incubatori con umidità (più costosi): Permettono un controllo superiore delle condizioni di coltura delle cellule

Le centrifughe consentono di:

• Rimuovere i reagenti
• Splittare le cellule (dividerle)
• Separare i liquidi dalle cellule che vivono in sospensione

Il microscopio invertito, infine, permette di osservare il cambiamento morfologico; quest’ultimo è spesso il primo segno di deterioramento in una cultura. L’ottica a fluorescenza è utilizzata per l’osservazione delle molecole fluorescenti all’interno delle cellule. I microscopi invertiti devono avere un ingrandimento da 10x a 100x. Il microscopio invertito permette di osservare le cellule in coltura e porre attenzione su:

• Morfologia delle cellule
• Verificare eventuale contaminazione
• Confluenza cellulare

Nei refrigeratori i mezzi liquidi sono mantenuti a 4 °C, mentre enzimi (ad es. tripsina) e componenti del mezzo (ad es. glutammina e siero) a -20 °C. Nel laboratorio possono essere presenti frigoriferi, freezer e bidoni di azoto liquido per raggiungere temperature di -195°/-210°.

Altre attrezzature comuni di laboratorio sono:

• Sistema di purificazione dell’acqua