Traduzione

Codice genetico

Il codice genetico del DNA è fondato su un alfabeto di 4 lettere, CAGT, come anche il codice genetico dell’RNA messaggero, anch’esso su 4 lettere CAGU. Era necessario quindi capire come venissero costruite le proteine, le quali hanno un alfabeto formato da 20 amminoacidi.

Quesiti fondamentali

I quesiti fondamentali a cui si è dovuto rispondere per comprendere il processo di traduzione sono stati:

• Qual è la lunghezza dell’unità base di codificazione?
• Qual è la sequenza di base delle “parole” di codice relativa a ciascuno degli amminoacidi codificati?
• Quali sono le modalità di riconoscimento tra le parole dei due diversi linguaggi?

Teoricamente se si avesse la relazione 1:1 tra nucleotide e amminoacido si potrebbero avere solo quattro amminoacidi. Se fossero due i nucleotidi, si otterrebbero amminoacidi, non ancora sufficienti. Per cui il minimo codice possibile risulta essere a tre, per cui amminoacidi, ovvero 64. Il passaggio successivo è stato quello di attribuire a ciascuna tripletta il significato, capire quindi per quale amminoacido codificasse ciascuna sequenza.

Esperimenti

Per fare questo sono stati eseguiti più esperimenti, tra cui:

• Nel primo esperimento sono state allestite 20 diverse provette, nelle quali erano presenti delle miscele di reazione che contenevano ribosomi, enzimi, ATP, GTP, tRNA e un tratto di RNA poliU, ovvero una catena costituita solo da basi U. Ad ogni provetta viene aggiunto un singolo amminoacido marcato radioattivamente. Visto che in queste provette era presente tutto il necessario per la sintesi proteica, laddove la tripletta UUU codificasse per un amminoacido, sarebbe iniziata la sintesi proteica e si sarebbe formato un peptide composto da quell’amminoacido. Se invece nessuna tripletta avesse codificato per quell’amminoacido, gli amminoacidi radioattivi sarebbero rimasti liberi nella soluzione della provetta e non si sarebbe formato il polipeptide. Si procede poi con una misurazione della centrifugata e una misurazione della radioattività. Ci si aspetta che l’amminoacido libero rimanga galleggiate, mentre l’amminoacido che viene utilizzato per formare il polipeptide rimanga attaccato ai ribosomi, per cui precipita sul fondo della provetta. L’ultimo passaggio consiste nel misurare la radioattività del corpo di fondo, per capire a quale amminoacido corrisponda la sequenza di RNA, e in questo caso la provetta che risulterà radioattiva sarà quella con l’amminoacido fenilalanina. Questo tipo di esperimento era adatto per capire a quali amminoacidi corrispondessero triplette con la stessa base ripetuta più volte, CCC AAA GGG UUU, in quanto non era necessario porsi il problema di dove iniziasse la lettura della sequenza.
• Nel secondo esperimento, l'esperimento di Nieremberg, vengono utilizzati ribosomi, un tRNA carico di un amminoacido marcato radioattivamente e una tripletta di RNA sintetico UCU. Il tRNA carico di un amminoacido specifico viene fatto reagire in provetta, per poi essere filtrato con un filtro poroso. Filtrando la miscela si potevano eliminare i tRNA che non si erano associati, e così rimanevano solo quelli corrispondenti al codone, in quanto avevano formato un legame grazie alla loro sequenza presente sull’anticodone. Per riconoscere gli amminoacidi bloccati nel filtro è stata misurata la radioattività.

Con questi e una serie di altri esperimenti si è riusciti a decifrare il codice genetico e a capire soprattutto perché 64 combinazioni di basi codificano solo per 20 amminoacidi. Il motivo per il quale non sarebbe stato compatibile con la vita che 20 sequenze codificassero per 20 amminoacidi e le restanti 44 per codoni non senso risiede nel fatto che la maggior parte delle mutazioni avrebbe portato ad una proteina tronca. La trascrizione si sarebbe fermata con l’amminoacido mutato, risultando quindi in una mutazione quasi sicuramente dannosa, incompatibile quindi con la vita.

Triplette e degenerazione del codice genetico

Sono solo tre infatti le triplette che non hanno alcun significato, UAA UAG UGA, tutte le altre sono associate ad amminoacidi. Tutti gli amminoacidi possono quindi essere richiamati da più triplette, un codice genetico definito degenerato. Nella maggior parte dei casi le triplette che codificano per lo stesso amminoacido sono molto simili tra loro, e questo è vantaggioso in caso di mutazione puntiforme, infatti se dovesse avvenire è molto probabile che la tripletta mutata codifichi comunque per lo stesso amminoacido. Sequenze simili codificano per amminoacidi con proprietà e strutture tridimensionali simili. Anche in questo caso un’eventuale mutazione potrebbe non portare un cambiamento fenotipico. Una peculiarità del codice genetico è che la sequenza AUG sia da una parte l’unica a codificare per la metionina e dall’altra la sequenza che dà l’inizio alla sintesi proteica.

RNA

Una volta che si ha un filamento di RNA è importante avere un sistema che definisca dove inizia la traduzione e con che sequenza di nucleotidi. In caso contrario si andrebbe incontro ad una traduzione caotica ed errata e la sequenza di amminoacidi sarebbe totalmente diversa.

Tipi di RNA coinvolti nella sintesi proteica

• RNA messaggeri o mRNA, che trasportano l’informazione sotto forma di ribonucleotidi, che vengono lette a sequenze di tre basi per volta per volta, chiamate codoni. All’interno di queste sequenze 5’-UTR e 3’-UTR, vi sono delle regioni importanti per il riconoscimento ed il legame al ribosoma per l’inizio della traduzione. La sequenza importante di legame del ribosoma nei procarioti è la sequenza Shine-Dalgarno, mentre negli mRNA eucariotici c’è una sequenza analoga a quella procariotica, con la differenza che quella procariotica è più conservata all’interno degli mRNA.
• RNA di trasferimento o tRNA, che sono i decifratori del codice, essendo in grado di leggere il codice attraverso un anticodone.
• RNA ribosomiali o rRNA, che insieme alle proteine ribosomiali formano i ribosomi, luogo in cui avviene tutto il processo.

Struttura del tRNA

Il concetto struttura-funzione è molto evidente nel tRNA. La sua struttura a trifoglio è infatti fondamentale per andare ad inserirsi in modo corretto all’interno delle tasche del ribosoma. Presenta due regioni particolari:

• Regione dell’anticodone, formato da 3 basi complementari ad una tripletta di basi sull’mRNA.
• Regione terminale, il 3’ della molecola, la zona accettore dell’amminoacido.

L’amminoacido viene caricato sul tRNA attraverso l’enzima amminoacil-tRNA-sintetasi. Esistono enzimi di questa classe specifici per diversi amminoacidi e tRNA. Tutte le amminoacil-tRNA-sintetasi presentano due tasche, la prima per uno specifico amminoacido e la seconda per il tRNA che deve legare quell’amminoacido. Grazie all’energia data dall’ATP l’enzima è in grado di formare un legame estere, ad alta energia, tra l’estremità 3’ del tRNA e l’amminoacido.

Il codice genetico utilizza 61 codoni diversi per specificare gli amminoacidi, quindi ci si dovrebbe aspettare di avere 61 tRNA differenti, per poi però caricarne molti con lo stesso amminoacido. In realtà sono meno di 61 codoni, anche se più di 20 (numero degli amminoacidi). Questo è possibile grazie alla flessibilità di appaiamento tra la terza base del codone e la corrispondente base dell’anticodone, ovvero la prima. La terza base del codone, che può essere A G C U, si può appaiare con una base anomala che non si ritrova né nel mRNA né nel DNA, l’inosina. Questa base particolare è in grado di fare 2 legami idrogeno con adenina, uracile e citosina. In questi appaiamenti, permettono di risparmiare sul numero di tRNA, c’è anche la peculiarità di U, che è in grado di appaiarsi con G con 2 legami idrogeno. Grazie a questo tentennamento è possibile effettuare una sintesi proteica in grado di riconoscere qualsiasi tripletta, rispettando il codice genetico, ma con un numero minore di tRNA minore di 60.

Traduzione nei procarioti

Inizio

La sintesi proteica dei batteri avviene vicino alla sequenza di Shine-Dalgarno, che serve fondamentalmente a posizionare l’mRNA, in modo tale che possa prendere contatto stabilmente con la subunità minore del ribosoma batterico, grazie ad una serie di fattori di inizio. Ciò consente inoltre di posizionare la prima tripletta tradotta, la tripletta AUG, a livello di un sito particolare di questa subunità. Una volta che l’mRNA è posizionato all’interno della subunità minore ed il primo amminoacil-tRNA si trova a livello della prima tripletta AUG, si unirà la subunità maggiore, che chiuderà così il complesso traduzione e consentirà l’avvio del processo di traduzione proteica.

La sequenza di Shine-Dalgarno è sempre al 5’ del primo codone ed è una sequenza che non è identica in tutti gli mRNA, pur possedendo una regione che è sempre ben conservata. In particolare, la sequenza AGGA o GAGG, è proprio quella che riesce a prendere contatto, attraverso l'interazione Watson e Crick, con un tratto del 3’ terminale del rRNA 16S, presente nella subunità minore del ribosoma procariotico.

Processo di inizio

Nella fase di inizio partecipano:

• mRNA, che deve essere tradotto
• Subunità minore 30S
• Subunità maggiore 50S
• Fattori di inizio, che devono facilitare ed operare i vari tipi di legame
• Amminoacil tRNA iniziatore, che porta la formilmetionina
• GTP, come fonte di energia

La fase di inizio consiste nel corretto appaiamento tra l’mRNA e la subunità 30S del ribosoma. Dapprima abbiamo il legame di tre fattori di inizio IF1, IF2, IF3, e di una molecola di GTP, con la subunità ribosomiale 30S. La subunità così attivata riesce a legare il tRNA iniziatore e l’mRNA. Si forma il complesso di pre-inizio, ovvero la subunità minore del ribosoma appaiata alla sequenza di Shine-Dalgarno, assieme ai fattori di inizio e alla fonte di energia (GTP). Questo scorre fino alla prima tripletta AUG, la tripletta di inizio, sempre presente entro una certa distanza dopo la sequenza di Shine-Dalgarno, che prende contatto con l’anticodone dell’amminoacil-tRNA, trasportante la formilmetionina.

Questo complesso si forma grazie al rilascio dei fattori di inizio IF1 e IF3, mentre IF2 rimane attaccato al GTP. L’idrolisi di GTP, con conseguente rilascio di GDP e di IF2, consente l’assemblamento ulteriore delle subunità 50S, la subunità maggiore, con formazione del complesso di inizio o complesso 70S. Il ribosoma è ora completo, l’mRNA è ben posizionato ed un primo amminoacil tRNA si trova all’interno di una delle tre tasche nella struttura del ribosoma, in particolare la tasca centrale o sito P, mentre le altre due sono ancora vuote.

Siti del ribosoma

• Sito E (exit), è il sito di uscita del tRNA scarico dall’amminoacido che porta
• Sito P (peptidico), dove entra il primo amminoacil tRNA e dove avviene la formazione del legame peptidico
• Sito A (accettore), dove vengono accolti i nuovi amminoacil tRNA

Il primo amminoacil tRNA porta la formilmetionina, che è complementare solo alla tripletta di inizio. Le altre triplette AUG presenti eventualmente nella sequenza di mRNA corrispondono invece alla metionina. Le cellule batteriche possiedono due diverse metionil-tRNA. Sono due molecole simili, con lo stesso anticodone, ma con sequenze leggermente diverse, e ciò fa sì che quello destinato a portare la formilmetionina modificherà la normale metionina per l’attacco al sito d’inizio. La formilmetionina ha una particolare capacità di entrare nel sito P per prima e avviare la sintesi proteica. Ci possono essere nella cellula altri amminoacil-tRNA, trasportanti formilmetionina, che però non sono in grado di entrare nel sito A, per cui in questa tasca vi entreranno solo quelli trasportanti la metionina.

Allungamento

Il secondo codone dell’mRNA viene esposto a livello del sito A. A questo punto entra l’amminoacil-tRNA corrispondente, ovvero l’unico in grado di instaurare legami a idrogeno con l’anticodone. Tutto ciò avverrà grazie a dei fattori di allungamento ed al GTP. Ora i due amminoacil-tRNA, uno nel sito P e l’altro nel sito A, si trovano molto vicini tra loro. Grazie alla peptidil-transferasi avverrà la formazione del legame peptidico, un legame molto più forte rispetto a quello che tiene legato l'aminoacido al tRNA, che comporterà dunque il distacco dell’aminoacido legato al primo tRNA, il quale rimarrà però attaccato al secondo amminoacido presente nel sito A.

L’amminoacil-tRNA nel sito P sarà ora scarico e lo scorrimento del complesso ribosomale farà sì che i due tRNA scorrano, il primo verso il sito E ed il secondo verso il sito P, lasciando libero il sito A che consentirà di ricominciare il ciclo, inserendo un nuovo amminoacil-tRNA carico. Per avere un nuovo codone a livello del sito A sono richiesti dei fattori di allungamento, EFG in particolare e sempre la GTP. La traslazione non è in realtà una traslazione completa in blocco, si ha prima una traslazione della subunità maggiore, che sposta i due tRNA nel sito P e nel sito E. In seguito si sposterà anche la subunità minore, consentendo al ribosoma di riassemblarsi. Il legame peptidico si ha quando i due siti A e P carichi, consentono ai due amminoacil-tRNA carichi, di avvicinare tra loro i due amminoacidi. Tale reazione detta di transpeptidazione è catalizzata da un’attività enzimatica della rRNA 23S, un ribozima.

Terminazione

La terminazione avviene quando nel sito A si ritrova una tripletta che corrisponde a nessun amminoacido, ovvero una delle triplette di stop UAA, UAG, UGA. L’assenza di un tRNA corrispondente e la presenza di fattori di rilascio in grado di inserirsi nella tasca A al posto dell’amminoacil-tRNA corrispondente, provoca un cambiamento conformazionale delle diverse componenti, che provoca il rilascio del polipeptide nascente ed il rilascio delle subunità ribosomiali disaccoppiate. Per fare questo sono necessari fattori proteici di terminazione, capaci di occupare la tasca A, e energia dal GTP. I codoni, una volta entrati nel sito A, non sono riconosciuti da nessun amminoacil-tRNA, ma sono riconosciuti dai fattori di rilascio RF1 e RF2. In particolare:

• RF1 riconosce le triplette UAA e UAG
• RF2 riconosce le triplette UAA e UGA

La sintesi proteica, per quanto riguarda il ribosoma che ha cominciato dalla sequenza leader sino a quella di terminazione del singolo pezzo di mRNA, si è così conclusa. Ogni mRNA è tradotto da più un complesso di poliribosomi. Non appena un ribosoma inizia la sintesi e la sequenza leader al 5’ si libera, si può inserire un secondo ribosoma e proseguire la sintesi proteica. Quindi nei procarioti, dove trascrizione e traduzione avvengono contemporaneamente, non c’è una compartimentalizzazione, ma i complessi di RNA polimerasi trascrivono quel particolare gene per poi disassemblarsi e lasciare spazio ad un altro complesso. Ad un pari numero di geni del mRNA policistronico si hanno un pari numero di proteine sintetizzate. Le sequenze codificanti, i geni, sono divise da RBS (ribosome binding site), in corrispondenza delle quali inizia la sintesi dei corrispettivi geni.

Traduzione negli eucarioti

Inizio

L’inizio è caratterizzato dalla formazione di due pre-complessi, che poi si fonderanno tra loro. Per la facilitare la formazione dei complessi, entrano in gioco molti fattori di inizio, tra cui:

• EIF1 (“E” sta per “eucariotico”), fattore coinvolto nel riconoscimento corretto del codone AUG
• EIF4F, EIF4E, EIF4A, EIF4G, sono necessari per legare l’mRNA alla subunità 40S ed hanno inoltre attività elicasica. Inoltre entrano in gioco nel processo di scanning
• Complesso EIF4E, fattore importante per il riconoscimento della struttura 5’ CAP.

Inizialmente la subunità 40S, ovvero la subunità minore eucariotica, si complessa con l’amminoacil-tRNA per la metionina. Tutto ciò accompagnato e favorito dall’interazione con i fattori di inizio EIF1A ed EIF3 ed all’interazione del tRNA con il fattore di inizio 2 ed il GTP. Questo forma un primo complesso, il complesso 43S o complesso di pre-inizio. Questo complesso verrà poi reclutato sul 5’ del mRNA, che deve essere tradotto.

Il complesso dell’mRNA è una struttura estremamente importante, che trasforma la molecola lineare dell’mRNA in una molecola circolare. Grazie all’assemblamento dei fattori di inizio EIF4E, EIF4G e la proteina PABP (in grado di legare le sequenze di poli A), l’mRNA si trova legato in due punti, a livello del cap ed a livello del poliA. Questo avviene per proteggere il filamento libero nel citoplasma. EIF4G è un fattore in grado di creare legami proteina-proteina, per legare il fattore che lega il cap al fattore che lega la poli A, chiudendo dunque questa cerniera. EIF4A, invece, impedisce alle possibili sequenze palindromiche di creare strutture stem loop, che bloccherebbero il passaggio della m...