Genetica II - Appunti

Caratteri quantitativi dei loci (QTL): loci associati a caratteri quantitativi

Un carattere quantitativo può essere l’altezza. I caratteri quantitativi sono determinati dalla segregazione di alleli di più geni che interagiscono insieme e con l’ambiente. Questi QTL sono spesso trovati su differenti cromosomi. Sono dei caratteri poligenici cioè controllati da più geni e multifattoriali cioè oltre al fattore geni esiste anche il fattore ambiente (es. dieta). Quindi i genetisti cercano di capire qual è l’ereditarietà di quella componente (genica e ambientale).

Troviamo caratteri quantitativi con una manifestazione continua: altezza, peso, colore della pelle, degli occhi, colore del sangue ma ci sono anche caratteri che si manifestano in modo dicotomo (il fenotipo o c’è o no): palatoschisi, diabete di tipo II, la displasia dell’anca. Bisogna anche cercare di capire come mai ci sono dei caratteri con manifestazione discontinua. La foto dà l’idea di come i singoli caratteri si possono piazzare come un punto qualsiasi del triangolo, ci possono essere quelli multifattoriali o quelli poligenici o quelli che risentono dell’ambiente.

Il numero di QTL che spiega la variazione della caratteristica fenotipica è molto variabile come è la loro contribuzione alla varietà fenotipica. Un carattere potrebbe essere controllato da molti geni svolgendo un piccolo effetto o da pochi geni con effetti maggiori. La distribuzione matematica di un QTL è la gaussiana.

Esempio di loci e varianti alleliche codominanti

Esempio: abbiamo dei loci che hanno varianti alleliche codominanti (vedo l’effetto di entrambi gli alleli nel fenotipo) con un effetto additivo (considerando l’altezza per ogni allele grande aggiunge 10 cm a un’altezza di base). Le classi grandi con 10 cm in più sono A, B, C mentre quelle piccole sono a, b, c. Nella popolazione la frequenza degli alleli è 0,5. Faccio in primis l’incrocio Aa x Aa ottenendo le proporzioni ¼ AA e aa e ½ Aa. Con un locus e due varianti ottengo tre classi fenotipiche.

Consideriamo due loci con B b, otteniamo cinque classi fenotipiche dalle proporzioni: 0 cm in più per aabb, 10 per Aabb e aaBb, 20 per AAbb e AaBb e aaBB, 30 per AABb e AaBB, e 40 per AABB. Quindi possono avere o 0 o 1 o 2 o 3 o 4 alleli grandi. Aggiungendo un terzo locus possono ottenere 7 classi fenotipiche in cui possono avere 0 o 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 alleli grandi. Quindi nel grafico si dispongono i dati e vanno a ricordare una gaussiana.

Quindi tanto maggiori sono i geni o gli alleli tanto maggiori saranno le possibili classi e le similarità alla continua variazione fenotipica. La quantità della variabilità umana si può spiegare con ampliamenti della genetica mendeliana.

Esempio: al contrario abbiamo già la gaussiana e ci chiediamo quali sono le basi genetiche (2 geni con due alleli) per ottenere le cinque classi diverse di colore degli occhi. La risposta la vediamo nella tabella. Lo stesso vale con il colore della pelle in cui abbiamo tre geni ciascuno con due alleli. Spiega uno spettro di variazione in cui abbiamo 7 classi diverse.

Esperimento di Federico Guglielmo di Prussia e regressione

Federico Guglielmo di Prussia era ossessionato da avere soldati altissimi quindi aveva favorito matrimonio tra individui alti. Questo tipo di esperimento non è molto efficace perché gli alleli avendo frequenza di 0,5 non tutti gli individui saranno omozigoti alleli grandi quindi probabilmente gli individui grandi non saranno omozigoti per tutti i loci, saranno prevalentemente eterozigoti anche perché i loci che interessano l’altezza sono più di cento. L’esito probabile di questo tipo di matrimonio è la probabilità che i loci in omozigosi nei genitori diventino eterozigoti nei figli, quindi saranno più bassi.

La prima regressione sull’ereditarietà della statura è stata fatta da Francis Galton il quale ha introdotto che caratteri nei genitori non sono passati completamente alla loro progenie. Ma i caratteri nei figli regrediscono verso il punto della media.

Regressione verso la media nella popolazione

Regressione verso la media nella popolazione: facendo la somma di tutti i fenotipi ottenuti per random mating nella popolazione ricostruisco la stessa popolazione. Quindi la distribuzione dei figli è uguale a quello delle madri. Per ogni classe fenotipica parentale, la progenie avrà fenotipo medio intermedio tra quello del genitore considerato e il fenotipo medio della popolazione. Per ogni classe fenotipica della progenie il fenotipo medio del genitore è intermedio fra il valore del figlio e la media della popolazione.

Caratteri dicotomi e valore di soglia

Troviamo anche dei caratteri dicotomi in cui il fenotipo o si presenta o non c’è. Ciò avviene nel caso di caratteri in cui servono un tot di alleli predisponenti per avere il fenotipo (avviene nei caratteri malattia). Si introduce un valore di soglia che se viene superata ci permette di vedere il fenotipo.

Considerando un individuo che vive in una famiglia con un malato ha maggiore probabilità di essere malato rispetto ad un individuo scelto a caso nella popolazione. Queste malattie con alleli predisponenti si sviluppano nelle famiglie. Infatti nel grafico vedo come la soglia rimane la stessa ma nella famiglia la probabilità di malattia è maggiore rispetto a quella nella popolazione. Il threshold effect dice che solo gli individui la cui suscettibilità supera una certa soglia manifestano la malattia (con numero di alleli predisponenti N>>x).

Ereditabilità e varianza

L’ereditabilità ci permette di capire quanto della varianza è attribuibile a fattori genetici e quanto a fattori ambientali, data la distribuzione normale. In una distribuzione normale, gaussiana, si calcola la varianza come s², allora anche l’ereditabilità potrà essere calcolata come un valore al quadrato. Il modello ideale prevede dei gemelli monozigoti per sperimentare quant’è l’ereditarietà cioè quale quota è dovuta da fattori genetici e da fattori ambientali. Così avrei uguale la componente genetica e posso vedere quella ambientale, facendoli crescere in ambienti diversi.

h² = Hereditability = Vg/Vg+Ve = Vg/Vp. L’ereditabilità viene definita come varianza genetica sulla varianza fenotipica (che è dato dalla componente genetica più quella ambientale).

Esempio: due linee pure di fagioli incrociate tra loro. Nella F1 la varianza del peso è 1,5. F1xF1=F2 ha una varianza di 6,1. Cerca l’ereditabilità del carattere peso per F2?

Mappare i QTL e studi di associazione

Ci sono due strade per mappare i QTL: una si basa su incroci che però nell’uomo non sono fattibili e l’altra sono studi di associazione.

Vediamo in primis gli incroci con un esempio in cui si fa l’analisi della quantità di tricomi su delle foglie. Abbiamo due linee pure nella generazione parentale. Faccio l’incrocio e ottengo una F1 con fenotipo intermedio e poi faccio più incroci F2xF2 per più generazioni così riesco a ricreare nuove linee pure diverse l’una dall’altra dato che ho rimescolato i pezzi dei cromosomi originali. Posso prendere le linee con lo stesso fenotipo e mi posso chiedere quale porzione di cromosoma è comune a tutte le piante con la stessa caratteristica. La regione uguale per tutte conterrà un tratto che influenza questo carattere.

L’approccio alternativo è dato dagli studi di associazione genome-wide: GWAS. Si basano sull’associazione fenotipo con varianti alleliche presenti nei casi rispetto ai controlli (es. per i casi si intende chi ha il diabete, mentre i controlli sono gli individui scelti che non ce l’hanno). Ciò presuppone che io non so lungo il genoma dove si collochi la variante che contribuisce a quel dato fenotipo, devo interrogare tutto il genoma. Quindi servono dei marcatori che si distribuiscono su tutto il genoma e poi li interrogo uno a uno. Mi chiedo se sul cromosoma 1, la variante 1 che ho più presente o meno nei casi rispetto ai controlli, la differenza è significativa e lo faccio per tutti.

Inizialmente disegno la distribuzione casi e controlli per capire quali siano le varianti genetiche che portano al determinato fenotipo. Per approdare ad una regione del genoma dobbiamo coprirlo tutto con i marcatori quindi ne servono molti allora si usano gli SNP cioè i single nucleotide polymorphisms. Il marcatore è usato quando non riusciamo a distinguere tra più varianti, quelli a singolo nucleotide sono i più comuni. La variante ci porta in una regione la quale può contenere più geni poi dopo dovrò capire quale sia. Posso creare un grafico in cui sulle ascisse trovo i cromosomi e sulle ordinate la significatività statistica della differenza della loro frequenza nei casi rispetto ai controlli, che mi dà una soglia di significatività.

Esempio: se la variante gialla è più presente nei casi rispetto ai controlli. Vedo una differenza statistica nei casi e nei controlli, questa è significativa. Quindi posso pensare che la variante gialla sia più predisponente al diabete I della variante rosa. Questo processo lo si può usare per: diabete di tipo I e II, livelli di emoglobina fetale, morbo di Crohn, altezza, valori di LDL e HDL, degenerazione maculare.

Ad esempio nella macular degeneration sono stati trovati tre loci che da soli spiegano il 50% dell’ereditabilità. Mentre per l’altezza ho 180 loci che spiegano solo il 12% dell’ereditabilità. A novembre 2020 è stato fatto uno studio su 4 milioni di persone e sono stati trovati 10000 loci per l’altezza con ereditabilità all’80%.

Come si studia il genoma/gene

Bisogna definire la struttura, funzione e regolazione. A partire dal genoma possiamo capire la sua sequenza, studiarne la funzione, oppure cercare di capire l’evoluzione della specie, prevedere malattie geniche e come contrastarle, posso vedere cosa succede con l’overespressione di un gene o un gene knockout o il rescuing di un gene.

Il sequenziamento e l’analisi di interi genomi si sviluppa con l’integrazione di: mappature geniche attraverso la linkage analysis cioè la localizzazione di un gene su un cromosoma, relativamente ad altri geni, usando incroci e genealogie e l’approccio bioinformatico per analizzare il genoma degli organismi.

• 1. Genomica strutturale – genetica e mappaggio fisico dei genomi
• 2. Genomica funzionale – analisi delle funzioni geniche/regolative (annotazione del genoma)
• 3. Genomica comparativa – confronto dei genomi di diverse specie, storia evolutiva dei genomi > Genomica evoluzionistica
• 4. Genomica medica - polimorfismi, geni malattia, variabilità genetica, farmacogenomica

Progetto di sequenziamento del genoma umano

Esempio: progetto di sequenziamento del genoma umano (1990-2003)

Sono stati usati due approcci logici diversi:

• → Mappatura sequenziale per allineamento progressivo dei frammenti sequenziati

È lento ma abbastanza accurato (Consorzio pubblico). Nella mappatura si ha la divisione del genoma in segmenti e il consorzio aveva poi dato alle diverse nazioni delle parti di cromosomi. Si fa il clonaggio in vettori e vengono sequenziati. Le sequenze sono state assemblate sulle mappe con enzimi di restrizione e sulla sequenza in sé. Dove ci sono dei buchi vengono risequenziati e quindi si rifinisce la mappa.

• → “Shotgun”: rottura casuale del genoma, sequenziamento e allineamento al computer delle sequenze dei frammenti ottenuti

È più veloce ma impreciso: problema sequenze ripetute, che si trovano in tutto il genoma (Celera corporation, Craig Venter). Rompo meccanicamente il genoma e lo faccio correre su un gel di agarosio e isolo frammenti con circa la stessa lunghezza che può essere facilmente sequenziata. Vengono assemblate e sovrapposte le sequenze. Ma si potrebbero fare errori con le sequenze ripetute.

Ma il genoma umano non è mai stato sequenziato completamente. Quella del 2003 è stato il primo draft di sequenziamento. Subito dopo di questo è partito il progetto 1000 genoma che deriva dal confronto delle sequenze di diversi individui che hanno portato al catalogo della variazione umana. Si pensa che nel 2025 le nozioni di genetica saranno maggiori dei tre maggiori produttori di informazioni: Twitter, YouTube, astronomia.

Bioinformatica e dati genomici

Per maneggiare la mole di dati è usata la bioinformatica che è data da matematica+genetica/computer. È usata per: identifica geni entro la sequenza completa del DNA, allinea e confronta sequenze geniche in un database per determinare la funzione, predice struttura e funzioni dei prodotti genici, descrive interazioni tra geni e prodotti genici e stima relazioni filogenetiche e di popolazioni. Ha permesso di capire che ogni circa 300 bp c’è una variazione. Il genoma un singolo individuo è unico (tranne quello dei gemelli monozigoti e degli organismi clonati).

Ad esempio su PubMed troviamo: la struttura del genoma, contenuto di DNA e numero di geni (anche a confronto con quello di altri organismi), gli elementi non-codificanti conservati (sequenze regolative, promotori..), non-coding RNA, idea della trascrizione e variazione genomica e la storia genetica della nostra specie (pelle chiara è recente data dalle popolazioni che si sono trasferiti al nord dove c’è meno sole).

Struttura del gene e librerie a DNA

Per studiare la struttura del gene è necessario ottenere la sequenza di DNA che lo contiene. Per isolarlo si usano le librerie a DNA che è una collezione di frammenti di DNA che è rappresentativo della cellula che vogliamo studiare. Per costruire la libreria devo scegliere il vettore di clonaggio che voglio usare ed è definito come una piccola molecola di sequenza nota, con replicazione indipendente dalla cellula nota, marcatori che permettono il riconoscimento della cellula trasformata e presenti in più copie per cellula (alto o basso numero).

La scelta del vettore di clonaggio deriva dalla considerazione della lunghezza che questi vettori possono ospitare, in ordine crescente: λ, plasmidi (10 kb), Fago cosmidi, YACs (Yeast artificial chromosomes) e BACs (Bacterial artificial chromosomes). Supponendo di voler clonare un gene umano, si cerca di capire la dimensione media di un gene cioè circa 50 kilobasi. Se uso un plasmide che contiene massimo 10 kb, il gene viene spezzettato e lo dovrò dopo ricostruire.

Se uso BAC che contiene 500 kb, oltre al mio gene avrà altre sequenze e dopo aver isolato il clone dovrò fare un lavoro di sub-clonaggio per isolare di nuovo la sequenza che mi interessa. Per la costruzione di libreria vengono spesso usate le Fago λ che contiene circa 15 kb.

Plasmide e selezione dei cloni

Il plasmide ha l’origine di replicazione per la loro moltiplicazione nei batteri, poi un marcatore di selezione che dà resistenza all’antibiotico, il sito di clonaggio è il multiple cloning site. C’è anche la selezione colore in cui se non c’è inserto, il gene intatto LacZ è intatto e può metabolizzare il substrato X-gal a dare un composto blu in presenza dell’induttore IPTG originando Colonie Blu mentre se c’è l’inserto, il gene LacZ è interrotto e si ottengono Colonie Bianche. Così dovrò cercare di isolare i cloni che contengono il mio gene di interesse.

Fago lambda e clonaggio

Abbiamo però detto che per le librerie genetiche viene preferito il Fago lambda, un virus batteriofago. È usato come vettore perché nella sua vita è in grado di svolgere due cicli: ciclo litico in cui si ha l’infezione e lisi della cellula batterica con il rilascio di nuove particelle fagiche e il ciclo lisogenico in cui si ha l’integrazione del genoma del fago nel DNA della cellula ospite.

I geni che controllano il ciclo lisogenico (circa 15 kb) possono essere rimossi (non essenziali per la sopravvivenza di lambda) e sostituiti con l’inserto di interesse. Tanto tolgo e tanto riesco a rimettere, infatti il Fago è in grado di scegliere frammenti di genoma di una lunghezza tale da riempirlo.

Fago lambda e il DNA che deve essere clonato vengono digeriti con lo stesso enzima di restrizione, in questo caso EcoRI. Si separa lambda in due braccia e vengono eliminati i geni del ciclo lisogenico che non servono alla replicazione e all’interno di lambda vengono clonati i frammenti dal genoma di interesse. Così ricostruisco un frammento di DNA con circa le dimensioni originarie di quelle del fago lambda e verrà inserito nel capside virale della testa del fago e produrrà nuove particelle virali.

Il sistema funziona perché all’estremità delle due anse del fago ci sono le sequenze COS, sono sequenze coesive che mediano l’introduzione del DNA all’interno del fago, sono riconosciute dal sistema di impaccamento nel capside. Nell’esperimento in vivo si forma uno strato uniforme di batteri e su questo si formano le placche di lisi (particella virale che porta un diverso inserto) su cui il fago agisce.

I Cosmidi plasmidi artificiali in cui sono inseriti frammenti di DNA di lambda, contenenti le sequenze «cos» (cohesive). Poi ci sono i BAC, PAC e infine YAC.

cDNA e libreria di cDNA

Il cDNA è il DNA che è stato retrotrascritto a partire dall’RNA grazie alla trascrittasi inversa. La libreria di cDNA è una collezione di frammenti di cDNA clonato (DNA complementare) inserito nei vettori, rappresentativo del trascrittoma della cellula data. La libreria di cDNA è l’immagine del trascrittoma di quella cellula in quel dato momento dello sviluppo. Sono differenti le librerie di cDNA prese in due momenti diversi dello sviluppo.

Il cDNA deriva dall’mRNA quindi ogni cellula esprime un proprio repertorio di mRNA diverso tra le varie cellule. Quindi il cDNA varia da tessuto a tessuto e a seconda del momento nello sviluppo. Il processo