Citogenetica

Introduzione alla citogenetica

La citogenetica è una branca della genetica che studia i cromosomi e il loro comportamento durante la mitosi e la meiosi, la loro origine e la loro relazione con la trasmissione e ricombinazione dei geni. Si occupa quindi di diverse cose, tra cui:

• La morfologia del DNA, la sua struttura e la sua organizzazione all’interno del nucleo.
• A livello fisiologico, il comportamento delle molecole di DNA durante le divisioni mitotiche e meiotiche.
• A livello patologico, i meccanismi che vanno a disturbare il percorso fisiologico delle molecole di DNA durante entrambi i tipi di divisione cellulare.

In particolare, la citogenetica medica si occupa dell’identificazione delle anomalie cromosomiche e la loro relazione eziologica e patogenetica con il fenotipo, e come conseguenza si occupa della prognosi del soggetto portatore e dei rischi di ricorrenza nella prole.

Articoli sulla citogenetica

Presentazione di alcuni articoli su cosa sia la citogenetica ad oggi:

• Il primo manoscritto non è stato ancora pubblicato e riguarda la sindrome di Down, la trisomia del cromosoma 21. Il cariotipo di una trisomia del 21 prevede 47 cromosomi per le cellule somatiche, di cui un cromosoma è moltiplicato per tre volte. Tuttavia, la trisomia del 21 non è l’unica causa della sindrome di Down: solo nel 95% dei casi si manifesta questa eziologia.
• Articolo scritto da italiani, circa il mosaicismo feto-placentare, identificato con la NIPT (Non-Invasive Prenatal Testing), ormai usata convenzionalmente per rilevare anomalie cromosomiche, analizzando il sangue periferico della gestante. Viene eseguito nel primo trimestre e va ad affiancare la translucenza nucale (NT), in cui si misura lo spessore della plica nucale, che non deve aumentare oltre un certo standard, altrimenti è indice patognomonico di anomalie cromosomiche. Da questo articolo, si evince quanto sia ancora importante effettuare analisi di citogenetica e non solo la NIPT, che sfrutta sequenziamento di nuova generazione (NGS), evoluzione del metodo Sanger.

È stato scoperto il legame fra anomalie cromosomiche e leucemie, grazie al caso del cromosoma Philadelphia, scoperto nel 1960.

Divisione della citogenetica

La citogenetica è divisa in due aree:

• Citogenetica costituzionale: studia le molecole di DNA presenti all’interno di un individuo già nato, per capire le cause di determinate caratteristiche patologiche. Ad esempio, può essere analizzato il sangue periferico di un individuo che presenta delle alterazioni morfologiche dismorfiche che fanno presupporre un’anomalia cromosomica, come la Sindrome di Down. È importante anche a livello prenatale per capire se il feto abbia delle anomalie cromosomiche, quindi si fa uno studio nelle diverse fasi della gravidanza, e nel caso venissero riscontrate delle alterazioni, salvo alcune eccezioni, come nel caso di mosaicismo, tutte le cellule del feto le presenterebbero.
• Citogenetica oncologica: possibili anomalie possono originarsi anche durante la mitosi, generando potenzialmente dei tumori. Si ha quindi la possibilità di studiare le caratteristiche somatiche di cellule tumorali prelevate con biopsie, le quali però si riferiscono solo a quelle cellule e non a tutte quelle dell’intero organismo.

Ancora oggi non si hanno tutte le risposte sul perché alcune anomalie cromosomiche provochino determinati fenotipi con caratteristiche patologiche (tumor burden, carico mutazionale dell’instabilità cromosomica). Ad esempio, non si sa quali siano tutte le relazioni tra l’anomalia del cromosoma 21 con i suoi geni presenti in triplice copia e il suo fenotipo Down.

Il cromosoma 21 è il più piccolo, ma non è stato messo all’ultimo posto, in quanto l’ordine è stato dichiarato prima dell’HGP. Esistono, inoltre, tanti bambini che non hanno ancora ricevuto una diagnosi per la loro patologia, perché soffrono di sindromi (compromissione di più organi) per le quali è difficile sovrapporre i vari segni clinici con una categoria di patologia già nota.

Importanza della ricerca

Sono state riscontrate delle problematiche legate ai cromosomi che spiegano anche la difficoltà, a volte impossibilità, nell’avere dei bambini. Questi sono alcuni dei motivi per cui bisogna attribuire una grande importanza alla ricerca, e non soltanto alla diagnostica. A questo scopo esistono tante associazioni che contribuiscono alla ricerca e nell’aiutare diverse persone con determinate patologie. Il genetista cerca la causa a una determinata condizione clinica. Prendendo ad esempio la fibrosi cistica può presentarsi per una nuova mutazione del gene CFTR o nell’altro partner, oppure per errore meiotico di segregazione (isodisomia uniparentale), che comporta la presenza della patologia, pur con un solo genitore presentante l’allele.

Storia della citogenetica

Inizialmente non era semplice contare il numero dei cromosomi umani. Tra i vari motivi di queste difficoltà, vi è il fatto che durante la preparazione dei cromosomi nei laboratori si usava una soluzione isotonica, e in questo modo i cromosomi in metafase si sovrapponevano lungo la piastra metafasica, non riuscendo quindi a distinguerli per bene. Nel 1956, però, grazie ad un errore di un tecnico di laboratorio che per sbaglio utilizzò una soluzione ipotonica, la cellula in metafase si gonfiò e si ottennero dei cromosomi ben distanziati, e tramite una soluzione in grado di fissare i cromosomi in quello stato, si riuscì finalmente a contarli. Tramite questa scoperta, nel 1959 vennero scoperte le prime anomalie numeriche dei cromosomi per quanto riguarda la sindrome di Down, la sindrome di Turner e la sindrome di Klinefelter.

Nel 1960 viene scoperta la prima anomalia di struttura, il Cromosoma di Philadelphia, che sarebbe una traslocazione cromosomica. Era un’anomalia piuttosto grossolana, che non necessitava quindi di alcun bandeggio per essere individuata, al contrario di altre anomalie che richiedono tale tecnica per identificare porzioni specifiche di ciascun cromosoma. Con l’ausilio del bandeggio, dagli anni ’70 in poi, sono state individuate altre anomalie dovute a micro-delezioni, duplicazioni e traslocazioni ricorrenti.

Organizzazione del DNA

Il DNA nella sua classica forma di organizzazione a doppio filamento, raggiunge una lunghezza di circa 2m. Per via delle proteine istoniche e non istoniche, però, riesce a raggiungere livelli di compattazione, che gli permettono di essere visto anche tramite il microscopio ottico. Una singola molecola di DNA compattata dalle proteine viene chiamata cromosoma. La cromatina è il nome generico del complesso DNA+proteine e ne esistono sei livelli di organizzazione:

• Classica doppia elica.
• Proteine istoniche H2A, H2B, H3, H4, tutte in duplice copia, che formano un ottamero. La doppia elica del DNA avvolge l’ottamero istonico tramite 2 giri, formando l’unità strutturale della cromatina, chiamata nucleosoma, una struttura dalla grandezza di circa 11 nm. Questo livello di organizzazione assume il nome di collana di perle.
• Solenoide, nel quale si trova l’istone H1, che non fa parte dell’ottamero, bensì ha come scopo di avvicinare i vari nucleosomi, facendo da collante. Ogni solenoide è costituito da 6 nucleosomi ad ogni giro. Questo livello di compattazione non permette l’avvicinamento dei fattori di trascrizione, per tale motivo nei nuclei interfasici può essere parzialmente decondensata a livello locale grazie a segnali e meccanismi epigenetici per permettere l’espressione dei geni.
• Negli stadi superiori di compattazione, bisogna immaginare la cromatina legata ad uno scaffold cromosomico costituito da un insieme di proteine presenti nel nucleo, che consentono l’aggancio specifico di regioni del DNA che non sono naturalmente espresse (es. zone ripetute).
• Man mano che aumentano i livelli di compattazione si arriva al massimo grado di compattazione, che è quello che si può osservare con il microscopio ottico, ovvero il cromosoma metafasico. In questo caso la cromatina non ha la funzione di espressione genica, ma ha una funzione meccanica. Esistono infatti regioni nel nucleo dove il DNA ha la funzione di esprimere i geni, e altre che mantengono queste specifiche sequenze in specifici punti del nucleo, durante la vita cellulare e nel ciclo delle diverse divisioni mitotiche.

All’interno del genoma esistono diversi tipi di categorie di DNA:

• DNA a sequenza unica: rappresenta il 46% del genoma e tra questi si trovano gli esoni dei geni codificanti per le proteine (1,2% del genoma) e le sequenze introniche (25%). In questo caso sono preoccupanti le microdelezioni o microduplicazioni dei cromosomi, perché potrebbero portare a aploisufficienza.
• DNA ripetitivo intersperso, rappresenta il 45% del genoma e comprende: sequenze LINE (Long INterspersed Elements, 20% del genoma) e SINE (Short INterspersed Elements, 12% del genoma), che sono di particolare importanza non soltanto nell’organizzazione del DNA, ma influiscono nei meccanismi che causano le alterazioni cromosomiche. Una traslocazione cromosomica ricorrente è quella tra il cromosoma 11 e il cromosoma 22. Retroelementi LTR, 8% del genoma, sono elementi retrotrasponibili che derivano dai retrovirus diventati ormai endogeni. Sono interspersi nel genoma, ma nonostante non si sappia ancora a che cosa servano, sono spesso state trovate negli studi dei punti di rottura dei cromosomi.
• DNA ripetitivo in tandem: rappresenta il 9% del genoma e si trova nei centromeri (α satellite), nelle sequenze pericentromeriche, anche se non sempre, (β satellite), nei telomeri, nelle sequenze subtelomeriche (minisatelliti) e in altre sequenze chiamate microsatelliti. Quest’ultimi sono altamente informativi, ipervariabili, e possono essere a singolo nucleotide, come gli SNP (single nucleotide polymorphism), polimorfismi che riguardano una singola base, e per tale motivo vengono utilizzati in medicina forense per indentificare il DNA derivato da piccole quantità di sangue o dai capelli. Questi sono le variabilità, che nella popolazione costituiscono più dell’1%, e occorrono principalmente nei cromosomi 1, 9 e 16. Sono innocui fino a prova contraria, ma non vanno mai sottovalutati.

L’importanza dei DNA satelliti è dovuta al fatto che i diversi coloranti sono specifici per i vari tipi di satelliti, quindi si possono utilizzare diverse tecniche di colorazioni sensibili a diverse parti dei cromosomi.

Cromosomi

La parola “cromosoma” significa corpo colorato, proprio perché sono osservabili tramite delle colorazioni al microscopio ottico. I cromosomi sono dei pacchetti di DNA. Ogni cromosoma contiene una singola molecola di DNA double strand compattata da una serie di proteine diverse (istoni e proteine non-istoniche), ma secondo recenti studi anche alcune molecole di RNA completano il quadro della cromatina. Esistono due tipi di cromatina:

• Eucromatina: parte più decondensata della cromatina, contiene geni attivamente espressi, che si replicano più precocemente in fase S rispetto all’eterocromatina. Con il bandeggio GTG viene mostrata bianca. I bandeggi, per questo motivo, localizzano regioni specifiche attivamente trascritte e precocemente duplicate, rispetto a quelle che non lo sono.
• Eterocromatina, ne esistono di vari tipi:
  • Costitutiva: si trova nei centromeri di tutti i cromosomi, nei telomeri e nella parte distale del cromosoma Y. Non contiene geni trascritti.
  • Facoltativa: per esempio, uno dei 2 cromosomi X nell’individuo femminile viene casualmente inattivato, e quindi condensato, e così come tutte le altre regioni eterocromatiche si replicherà più tardivamente durante la fase S.
  • Variabile: specifica per i cromosomi 1, 9, 16 costituisce il polimorfismo delle regioni ripetute di questi cromosomi.

Prendendo in considerazione un cromosoma metafasico, si possono notare diverse strutture tra cui:

• Centromero, a livello del DNA, serve per una corretta divisione cellulare. In caso di presenza ravvicinata di due centromeri nello stesso cromosoma, uno dei due viene inattivato.
• Cinetocore, due per ogni cromosoma, ed è l’apparato proteico che aggancia il cromosoma a livello del centromero per permettere l’aggancio con il fuso mitotico.
• A livello della regione centromerica si trova la costrizione primaria.
• Braccio corto p (dal francese “petit”).
• Braccio lungo q (dal francese “queque”).

Tra gli elementi essenziali di cromosoma, oltre che al centromero, vi sono:

• Telomeri: sono spesso due, ma con l’invecchiamento possono essere persi. Per tale motivo analizzando i telomeri si può stabilire l’età della cellula.
• Origini di replicazione.

Quando la denominazione del sesso è controllata dall’assortimento di particolari cromosomi (nell’uomo X e Y), questi vengono chiamati eterosomi, mentre le restanti coppie autosomi. Esistono errori di segregazione, che impediscono ai cromosomi sessuali o ai cromosomi autosomici di separarsi correttamente, per questo è possibile avere la trasmissione di una malattia genetica, che non segue le leggi di Mendel.

I cromosomi venivano osservati dopo l’allestimento del preparato su un vetrino con un ingrandimento 40x, in corrispondenza del quale appaiono corpi con colorazione tendente al grigio scuro. Si visualizzano i cromosomi, si contano, ma non si distinguono.

I cromosomi acrocentrici hanno una sequenza che sporge dal braccio corto, chiamata satellite. Il satellite è legato al centromero e al braccio lungo del restante cromosoma con una sequenza di DNA ripetuta, che codifica per l’RNA ribosomiale, necessario per costituire, insieme alle proteine ribosomiali, il ribosoma. È possibile che in un cariotipo appaiano dei satelliti al di fuori di un cromosoma acrocentrico e con possibili satelliti derivanti da rotture dei satelliti dei cromosomi acrocentrici, potrebbero insorgere problemi nella fertilità.

Ciclo mitotico e meiosi

La mitosi è una delle varie fasi del ciclo mitotico, nel quale la cellula si divide. Il ciclo cellulare invece comprende tutte le fasi: G1, S, G2, mitosi. La durata del ciclo cellulare varia in base al tipo cellulare, ma la mitosi dura circa 1 ora. È possibile distinguere le diverse sottofasi della mitosi non solo dal punto di vista molecolare, ma anche al microscopio.

Nella profase i cromosomi sono molto allungati, nella prometafase, invece, i cromosomi sono un po’ più corti, ma ancora più lunghi dei cromosomi metafasici. Nella metafase i cromosomi sono più corti e più cicciotti, sono utili per il conteggio e per distinguere alcune bande, ma per localizzare meglio i punti di rottura si utilizzano i cromosomi prometafasici, i quali, essendo più lunghi, mostrano le varie bande ad una risoluzione più alta. Nell’anafase i cromatidi fratelli sono già divisi. Nella telofase si trovano ai poli della cellula e alla fine avviene la citocinesi.

Considerando che l’interfase ha come obiettivo di preparare la cellula per la mitosi, e di avere due cellule figlie con lo stesso numero di cromosomi, il contenuto di DNA varia durante le diverse fasi del ciclo mitotico. In fase G1 si hanno 46 cromosomi, ma un quantitativo di DNA pari a 2C in quanto il DNA non è stato ancora duplicato e ciascun cromosoma è formato da una singola doppia elica. Alla fine della fase S, dopo la duplicazione, si hanno sempre 46 cromosomi, ma il contenuto di DNA è pari 4C, ovvero il doppio rispetto alla fase G1, in quanto ciascun cromosoma è formato da due doppie eliche. Durante la fase M si hanno 46 cromosomi condensati, mentre in telofase la cellula contiene ben 92 cromosomi, dato che non è ancora avvenuta la citochinesi ma i cromosomi si sono già divisi in cromatidi fratelli. In questa fase si segnano 92 cromosomi e ciascun nucleo nella cellula ha 2C (nell’insieme ancora 4C).

La meiosi non può essere chiamata ciclo, perché i gameti non hanno la possibilità di tornare ad essere diploidi. Nella meiosi si ha un’unica duplicazione del DNA. Dalla prima divisione, che si chiama riduzionale, si ottengono 23 cromosomi, che mantengono i cromatidi fratelli, i quali vengono separati nella seconda divisione meiotica (il numero di cromosomi resta 23).

Cariotipo e analisi cromosomica

Il cariotipo rappresenta il caratteristico assetto di cromosomi in ogni specie, che si mantiene costante per numero e morfologia, di generazione in generazione. Normalmente, il numero di cromosomi rimane quindi costante nelle cellule somatiche delle specie, dove c’è contenuto diploide. Le cellule germinali hanno contenuto aploide.

Fare la cariotipizzazione significa costruire, coppia per coppia, la formula cariotipica di una cellula. Il referto dipende dal campione di partenza, ad esempio un’analisi sulle cellule del sangue periferico dà un referto costituzionale, a meno che si tratti di leucemia o di tumori delle cellule del sangue, mentre analizzando le cellule di un glioblastoma si ottiene un referto di sole quelle cellule. Importante è definire il numero di cromosomi e l’esistenza di anomalie strutturali al limite del bandeggio. L’analisi del cariotipo si effettua confrontando il cariogramma, ovvero la rappresentazione grafica ordinata del corredo cromosomico di un individuo, dalla quale si può studiare il bandeggio e capire se esistono alterazioni strutturali, con un riferimento normale, chiamato idiogramma. Questo si può trovare in un catalogo aggiornato a livello internazionale, chiamato ISCN (International System Cytogenomic Nomenclature).

Per ricostruire il cariotipo completo, quindi, servono delle tecniche di bandeggio, che permettono di riconoscere i cromosomi, i quali presentano una loro specificità. Questi ultimi hanno una varietà di colorazioni:

• Fondo bianco (GTG banding): contrasto fra bande nere e bande bianche.
• Fondo nero (QFQ banding): contrasto fra bande fluorescenti (es. quinacrina) e bande non fluorescenti (foto in camera buia).
• Fondo bianco (REVERSE del GTG).