Batteriologia per l'esame di Microbiologia

Microbiologia generale

La microbiologia è lo studio dei microbi. Il nostro organismo è popolato da una microflora con un numero di cellule superiore alle nostre stesse cellule: 90% cellule batteriche e 10% cellule umane. La microbiologia si suddivide in diversi settori di studio: batteriologia, virologia, micologia, protozoologia. Il microscopio è uno dei dispositivi fondamentali che la microbiologia utilizza e ne esistono diversi, in particolare microscopi ottici e microscopi elettronici.

Microscopi ottici

• Microscopio a campo chiaro: evidenzia l’oggetto che si vuole ingrandire utilizzando dei fasci di luce. È il più utilizzato e ha un potere di risoluzione di 0,2 micron.
• Microscopio a contrasto di fase: crea contrasti utilizzando la diffrazione della luce.
• Microscopio a campo scuro: serve a visualizzare batteri molto sottili, utilizzando un dispositivo che scurisce il fondo facendo sì che i corpuscoli presenti restino colpiti dalla luce. Ha un potere di risoluzione di 0,02 micron.
• Microscopio a fluorescenza: il campione viene marcato con dei fluorocromi che riescono a marcare anche batteri molto piccoli, difficili da vedere.

Microscopi elettronici

Il microscopio elettronico usa fasci di elettroni per illuminare gli oggetti e serve a visionare i virus. Ha un potere di risoluzione di 0,1-0,4 nm. La preparazione dei campioni è complessa e costosa.

Batteriologia generale

Postulati di Koch

Per stabilire se un microrganismo è responsabile di una certa patologia:

• L’organismo sospetto patogeno deve ritrovarsi in tutti i casi di malattia ed essere assente in animali sani.
• L’organismo sospetto deve poter crescere come coltura pura.
• Le cellule di una coltura pura dell’organismo sospetto devono indurre malattia in animali sani.
• L’organismo deve poter essere nuovamente isolato e se ne deve poter dimostrare l’identità con l’originale.

La classificazione batterica

Gli esseri viventi sono divisi in cinque regni all’interno dei quali ci sono delle linee evolutive con raggruppamenti gerarchici basati sulla comunanza di caratteristiche genotipiche e fenotipiche. Con la scoperta del DNA si è passati a tre domini: Bacteria, Archaea, Eucarya.

• Dominio
• Phylum
• Classe
• Ordine
• Famiglia
• Genere
• Specie

Distinzione tra eucarioti e procarioti

La cellula eucariote ha un vero e proprio nucleo; i procarioti non hanno un nucleo. Gli eucarioti nella regione nucleare presentano diversi cromosomi; i procarioti hanno un solo cromosoma. Gli eucarioti presentano gli istoni e hanno degli organuli necessari per la mitosi. Nella cellula procariote sono presenti i ribosomi, ma sono più piccoli di quelli eucarioti.

Morfologia dei batteri

Morfologicamente possono presentarsi in varie forme:

• Cocchi: forma rotonda, singoli o raggruppati in catenelle (streptococchi). Se sono a grappolo prendono il nome di stafilococchi.
• Bacilli: allungati a bastoncello.
• Coccobacilli: non hanno forma né completamente tonda né completamente a bastoncello.
• Vibrioni: presentano una piccola curva.
• Spirilli: presentano una forma ondulata.
• Spirochete: forme ancora più allungate degli spirilli.
• Filamentosi

Batteri Gram positivi e Gram negativi

I batteri possono essere distinti in Gram positivi o Gram negativi a seconda della colorazione che assumono. I Gram positivi hanno una colorazione di tipo violetto, una membrana citoplasmatica, una parete molto spessa e una capsula. I Gram negativi hanno una capsula molto spessa, una parete cellulare molto sottile; verso l’esterno ci sono strutture che nei Gram positivi non sono presenti: membrana esterna, pili.

Citoplasma e membrana plasmatica dei batteri

Il citoplasma è amorfo con presenza di ribosomi e RNA beante (non c’è un nucleo). Si definisce nucleoide la zona dove si trova il DNA del batterio. Presenta strutture come i ribosomi, la membrana plasmatica, la parete cellulare, la capsula, i pili e il flagello. Oltre ai ribosomi, non ci sono strutture citoplasmatiche. I ribosomi dei procarioti sono più grandi di quelli degli eucarioti: 30S + 50S = 70S. Sono presenti classi di antibiotici che hanno come bersaglio i ribosomi batterici per inibirne la replicazione. La membrana plasmatica è simile a quella eucariotica e ha la funzione di trasportare sostanze e molecole in maniera passiva e attiva, oltre a essere la sede dei processi sintetici delle strutture del batterio. Il peptidoglicano è la componente principale della parete cellulare. Il doppio strato fosfolipidico è costituito al 40% da lipidi e al 60% da proteine, oltre a pochi carboidrati e assenza di steroli.

Nella membrana sono presenti delle invaginazioni, i mesosomi, che permettono l’ancoraggio e la separazione dei cromosomi durante la replicazione del batterio per scissione binaria. La membrana plasmatica rappresenta una barriera idrofobica, impermeabile alla maggior parte delle molecole idrofile. I meccanismi di trasporto possono essere sia attivi che passivi:

• Diffusione (passivo): non richiede energia, la sostanza diffonde spontaneamente dal compartimento in cui è più concentrata a quello in cui è meno concentrata; sostanze come acqua, ossigeno e anidride carbonica.
• Uniporti (attivo)
• Simporti (attivo)
• Antiporti (attivo)
• Trasporto ABC
• Traslocazione di gruppo

La parete batterica

Struttura più esterna rispetto alla membrana plasmatica. Involucro rigido, spesso e pluristratificato. Il componente principale è il peptidoglicano (mucopeptide o mureina). La composizione della parete batterica differisce molto tra Gram positivi e Gram negativi:

• Nei Gram positivi lo strato di peptidoglicano è particolarmente spesso.
• Nei Gram negativi, all’esterno della membrana plasmatica (tra la membrana e la parete batterica) c’è lo spazio periplasmatico, seguito da uno strato molto sottile di peptidoglicano.

La parete è fondamentale poiché al suo interno sono situati gli antigeni fondamentali per scatenare la risposta immunitaria. La diversa struttura della parete determina la diversa colorazione tramite la colorazione di Gram, che avviene secondo i seguenti passaggi:

1. Si effettua la prima colorazione del preparato con il colorante cristal-violetto.
2. Si effettua fissaggio con lo iodio.
3. Si effettua la decolorazione.
4. Si effettua la seconda colorazione con safranina.

I Gram positivi hanno uno spesso strato di peptidoglicano che non perdono il primo colorante durante la decolorazione e rimangono colorati di viola scuro. I Gram negativi hanno uno strato di peptidoglicano molto sottile, vengono decolorati dall’alcol e colorati dal secondo colorante, il risultato finale è di color rosa.

Composizione del peptidoglicano

È costituito da un intreccio di strutture peptidiche e glucidiche in una trama reticolata. Ci sono lunghe catene lineari formate da due carboidrati azotati: N-acetilglucosammina e acido N-acetilmuramico. Il NAM lega dei corti peptidi che, legandosi tra di loro, collegano trasversalmente catene parallele. I legami trasversali possono essere inframezzati da un peptide pentaglicinico; ogni strato di peptidoglicano è di fatto costituito da un’unica catena. I componenti del peptidoglicano sono target di antibiotici. Nella parete cellulare dei Gram positivi sono inseriti anche gli acidi teicoici, polimeri di alcol polivalenti che hanno funzione energetica.

Nei Gram negativi, esternamente, si trova il lipopolisaccaride (LPS) molto importante dal punto di vista patogeno; all’interno del LPS sono presenti dei canali costituiti da porine.

Membrana esterna e lipopolisaccaride

All’esterno della parete batterica dei Gram negativi, internamente rispetto al LPS, si trova la membrana esterna, una struttura bistratificata composta di fosfolipidi. Il lipopolisaccaride (endotossina) costituisce la porzione più esterna della struttura del batterio Gram negativo. Tra la membrana plasmatica e la membrana esterna è presente lo spazio periplasmico che contiene anche un gel proteico costituito da proteine di legame, enzimi e oligosaccaridi coinvolti nella regolazione osmotica.

Il lipopolisaccaride ha tre strutture:

• Lipide A: responsabile della tossicità dell’LPS.
• Core polisaccaridico
• Catena laterale polisaccaridica: attività antigenica, contraddistingue le diverse specie di batteri; attraverso lo studio della catena laterale è possibile tipizzare i batteri.

Il contatto dell’LPS con il nostro organismo determina una serie di risposte infiammatorie e immunitarie. Ad esempio, la cascata di produzione delle citochine è responsabile della febbre, del reclutamento di linfociti T, macrofagi e monociti. A livello dell’endotelio, LPS altera le giunzioni tra le cellule causando edema, ipotensione e shock. L’LPS è anche in grado di attivare il complemento e la cascata di coagulazione, portando a coagulazione intravascolare disseminata.

In alcuni batteri è presente la capsula, un involucro mucoso, amorfo, viscoso, esterno alla parete. Può essere ben strutturato oppure del tutto amorfo, ed è costituito da polisaccaridi secreti dal batterio. La struttura è evidente al microscopio e conferisce virulenza perché permette al batterio di aderire e colonizzare. Un’altra funzione della capsula è quella protettiva, resistere alla fagocitosi e all’azione del sistema del complemento.

Un’ulteriore struttura del batterio è il flagello, che conferisce mobilità attiva in risposta a stimoli chimici o luminosi. È costituito da diverse proteine (principalmente flagellina) e può essere singolo o multiplo. I movimenti concessi dal flagello sono di avanzamento, retrocessione e rotazione. Strutturalmente si osservano un corpo basale, un gancio e il flagello vero e proprio, che si muove grazie all’energia ricavata dall’idrolisi dell’ATP.

La peluria presente sui batteri è costituita da pili, appendici composte da polimeri di pilina che consentono l’adesione a superfici inerti ed epiteli, e possono portare alla formazione del biofilm. Un pilo particolare è il pilo sessuale, che permette a due batteri di scambiarsi materiale genetico mediante un processo detto coniugazione.

Il biofilm è un aggregato di complessi costituiti da una matrice adesiva esterna (acellulare) e, all’interno, cellule microbiche. La matrice è secreta dai batteri stessi e ha funzione protettiva; può aderire a superfici biologiche o inerti.

La differenza tra endotossine ed esotossine sta nella possibilità di contrastare le prime con gli anticorpi: inutili contro l’LPS, è sufficiente un ridotto accumulo di LPS per far salire la febbre.

Metabolismo batterico

Attraverso le reazioni metaboliche vengono prodotte o usate sostanze molto specifiche, rilevabili attraverso test biochimici. È possibile identificare la specie di appartenenza del batterio analizzato come marker vengono usati metaboliti terminali ed enzimi. I batteri possiedono un anabolismo e un catabolismo; l’energia chimica coinvolta è tendenzialmente legata all’ATP.

Gli organismi viventi possono essere distinti in molti modi, tra cui la fonte di energia:

• Fotosintetici: luce
• Chemiosintetici: sostanze chimiche, si dividono ulteriormente in litotrofi (da composti inorganici) e organotrofi (da composti organici)

Se il carbonio utilizzato è di origine organica si tratta di organismi eterotrofi, se il carbonio utilizzato è di origine inorganica si tratta di organismi autotrofi. Batteri sono organismi chemiosintetici organotrofi eterotrofi (come gli esseri umani). Il catabolismo batterico è caratterizzato principalmente da reazioni di ossidoriduzione, fosforilazione a livello del substrato e reazioni di respirazione.

È possibile classificare i batteri in base a come si rapportano all’ossigeno:

• Aerobi obbligati: hanno bisogno di ossigeno per replicarsi
• Aerobi o anaerobi facoltativi: in grado di crescere in presenza o in assenza di ossigeno
• Anaerobi obbligati: non sopravvivono in presenza di ossigeno, producono ATP per fermentazione, sono assenti gli enzimi per la detossificazione da radicali liberi (catalasi e superossido dismutasi)
• Microaerofili: crescono in presenza di aria addizionata del 5/10% di anidride carbonica

Riproduzione e crescita batterica

I batteri si riproducono per scissione binaria, una riproduzione asessuata: da una singola cellula batterica si ha allungamento, invaginazione di membrana, creazione di un setto e divisione vera e propria. Il cromosoma batterico si è duplicato e quindi le cellule figlie sono geneticamente identiche alla cellula madre. La crescita di una colonia batterica avviene in quattro fasi:

1. Fase di latenza: si ha adattamento e nessuna divisione
2. Fase di crescita esponenziale: varia in base alla natura del batterio
3. Fase stazionaria: le cellule che si riproducono sono circa bilanciate da quelle che muoiono; la colonia non varia di numero
4. Fase di morte: la velocità con cui le cellule muoiono supera quella di riproduzione

I batteri non sono per forza dipendenti da un unico tipo di nutriente, possono variare la propria dieta in base alla disponibilità ambientale: crescita diauxica.

Spore batteriche

Alcune specie di batteri (circa una ventina di specie) possono esistere in due forme: vitale e quiescente (sotto forma di spore). La capacità dei batteri di generare spore che sopravvivono per lungo tempo in condizioni avverse è ciò che li rende pericolosi per l’uomo. Nello stato quiescente (in seguito a germinazione), il consumo di ossigeno e nutrienti è quasi nullo e la resistenza a disidratazione e a temperature estreme è molto alta. Le spore possono sopravvivere anche alle radiazioni. Nelle giuste condizioni di temperatura e umidità, le spore possono ritornare allo stato vitale: fenomeno di germinazione. Le spore hanno una struttura quasi sferica e presentano all’interno il materiale genetico del batterio da cui derivano. Sono ricoperte da numerosi strati, che conferiscono particolare resistenza. Presentano un pH più basso della cellula vitale e contengono due sostanze caratteristiche: acido dipicolinico e ioni calcio.

Genetica batterica

I batteri presentano un unico cromosoma circolare. Non sono presenti istoni. Non sono presenti regioni non codificanti (introni). Non hanno un nucleo, né organelli citoplasmatici organizzati. Una singola molecola di mRNA può portare a più peptidi differenti (policistronico). Sono presenti i plasmidi, unità genetiche accessorie separate dal cromosoma. C’è accoppiamento di trascrizione e traduzione nel citosol, determinando rapidità dei processi e adattamento ambientale. La replicazione del cromosoma è semiconservativa. Gli enzimi della machinery replicativa sono gli stessi di quella umana. Durante la replicazione, il materiale genetico può mutare: variabilità genica fondamentale per l’evoluzione e l’adattamento del batterio. Tali mutazioni si distinguono in:

• Microlesioni: piccole, sostituzione di singole basi e frame-shift
• Macrolesioni: delezioni, inversioni, traslocazioni e duplicazioni

I batteri hanno la possibilità di scambiarsi il materiale genetico in tre modi differenti:

1. Trasformazione: trasferimento di frammenti di DNA batterico da una cellula lisata a una integra.
2. Coniugazione: trasferimento di DNA plasmidico o genomico mediante contatto tra cellule attraverso il pilo sessuale.
3. Trasduzione: trasferimento di geni batterici mediato da virus batteriofagi.

Le trasposizioni

La trasposizione è l’evento attraverso il quale una o più sequenze di DNA traslocano da una zona all’altra del genoma; tale trasferimento avviene all’interno del batterio stesso. Le sequenze di DNA coinvolte possono essere:

• Sequenza di inserzione: piccoli segmenti di DNA che si spostano di 800-2000 basi
• Trasposoni: hanno dimensioni maggiori, si tratta spesso di geni per la farmacoresistenza
• Elementi invertibili: inversione di due tratti di genoma (che codificano anche per le DNA invertasi, che permettono l’inversione stessa)

Classificazione dei batteri

Il concetto di specie batterica si basa su somiglianze in caratteristiche di tipo numerico e genotipico. La classificazione si basa sulla divisione in gruppi per via di somiglianze e correlazioni dal punto di vista evolutivo. Una specie batterica è un insieme di isolati batterici che condividono molte caratteristiche e allo stesso tempo differiscono notevolmente da altre specie. Un isolato batterico (ceppo batterico) è una popolazione di microrganismi che discende da un singolo organismo o una singola coltura pura. All’interno di un ceppo ci possono essere differenze:

• Biochimiche e fisiologiche
• Morfologiche
• In proprietà antigeniche

Diagnosi microbiologica

Se si sospetta infezione batterica, ci sono due modi diagnostici:

1. Diagnosi diretta: si cerca l’agente patogeno o le sue componenti attraverso un esame colturale di un campione batterico cresciuto su un terreno appositamente scelto. Si fa poi identificazione della specie batterica e antibiogramma per capire quale sia il farmaco più efficace.
2. Diagnosi indiretta: si concentra la ricerca sulla risposta immunitaria dell’organismo contro quel patogeno all’interno del siero del paziente, con ricerca di anticorpi contro un determinato patogeno.