Appunti di Genetica

Genetica del DNA: funzione e struttura

Caratteristiche del materiale genetico

Affinché una molecola funga da materiale genetico, deve presentare quattro caratteristiche cruciali: replicazione, conservazione delle informazioni, espressione delle informazioni e variazione per mutazione. Una volta che il materiale genetico delle cellule si replica e viene raddoppiato in quantità, deve essere suddiviso equamente - attraverso la mitosi - in cellule figlie. Il materiale genetico viene replicato anche durante la formazione dei gameti, ma viene ripartito in modo tale che ogni cellula ottenga solo la metà della quantità originale di materiale genetico, il processo di meiosi.

La memorizzazione delle informazioni richiede che la molecola funga da deposito di informazioni genetiche che possono o meno essere espresse dalla cellula in cui risiede. I geni sono unità di informazione biologica.

Definizioni del gene

• Definizione classica (Mendel): unità di materiale genetico che specifica una data funzione. È un tratto trasferito da genitore in figlio.
• Definizione biomedica: segmento di DNA che specifica una catena di polipeptidi. Un gene → un polipeptide.
• Definizione molecolare: sequenza di DNA che è trascritta come singola unità (unità di trascrizione) e codifica uno o un gruppo di polipeptidi.

Scoperte storiche sul DNA

All'inizio del '900 i genetisti sapevano che: i geni controllano l'eredità dei caratteri, sono localizzati sui cromosomi, e i cromosomi sono costituiti di DNA e proteine. Inizialmente si pensava che le proteine fossero il materiale genetico. Esperimenti condotti tra il 1928 e il 1952 convinsero i genetisti che il materiale genetico fosse il DNA.

Le prime ricerche significative furono condotte da Frederick Griffith, che condusse una serie di esperimenti con diversi ceppi del batterio Streptococcus pneumoniae. Alcuni erano ceppi virulenti e causavano polmonite in alcuni vertebrati (in particolare umani e topi). Questi ceppi sono in grado di sintetizzare una capsula gelatinosa polisaccaridica, che circonda il batterio e lo protegge dal sistema immunitario dell'animale infetto. La capsula avvolgente allarga le dimensioni delle colonie batteriche e conferisce loro un aspetto luccicante e liscio (Smooth).

Alcuni ceppi, non sono tuttavia in grado di sintetizzare la capsula polisaccaridica e formano piccole colonie che hanno una superficie ruvida (Rough). Entrambi i tipi di batteri si riproducono producendo una discendenza con il tipo capsulare del genitore (S o R). Quando topi vengono iniettati con cellule viventi R o con cellule S che sono state uccise con calore estremo, gli animali rimangono sani. Tuttavia, Griffith dimostrò che quando ai topi veniva iniettata una miscela di cellule R viventi e cellule S uccise, questi spesso morivano di polmonite. Infatti, i batteri isolati dai campioni di sangue dei topi morti producono colture con una capsula tipica delle cellule S.

Quindi i batteri R possono essere sottoposti a trasformazione in batteri S grazie a uno scambio di materiale genetico e le nuove caratteristiche sono ereditate dai discendenti dei batteri trasformati. Nel 1944, Avery, MacLeod e McCarty dimostrarono che la sostanza responsabile della trasformazione delle cellule R in cellule S era il DNA. L'esperimento prevedeva l'utilizzo di procedure chimiche per ottenere il DNA in forma quasi pura dalle cellule batteriche, cosa che non era mai stata fatta prima.

Quando aggiunsero il DNA isolato dalle cellule S alle colture crescenti delle cellule R, osservarono che venivano prodotte alcune cellule di tipo S. Sebbene i preparati di DNA contenessero tracce di proteine e RNA, l'attività di trasformazione non risultava alterata da trattamenti che distruggevano proteine o RNA. Tuttavia, i trattamenti che prevedevano l’uso di DNAasi che degradavano il DNA, eliminavano l'attività di trasformazione. Questi esperimenti dimostrarono pertanto che la sostanza responsabile della trasformazione genetica fosse proprio il DNA della cellula, e quindi che il DNA fosse il materiale genetico.

Esperimenti di Hershey e Chase

Nel 1952, Hershey e Chase studiavano le cellule del batterio Escherichia coli in seguito all'infezione da parte del virus batteriofago T2, che consiste nell'attacco della particella fagica alla parete cellulare batterica, l'ingresso del materiale fagico nella cellula, la moltiplicazione di questo materiale per formare una progenie e quindi il rilascio di questa mediante lisi della cellula batterica.

I fagi sono composti da DNA e proteine in uguali quantità. Poiché il DNA contiene fosforo ma non zolfo, mentre la maggior parte delle proteine contiene zolfo ma non fosforo, è possibile marcare il DNA e le proteine mediante l'uso di isotopi radioattivi dei due elementi. Cellule di E. coli non radioattive furono infettate con fagi marcati con ³²P o ³⁵S per seguire il DNA e le proteine separatamente. La maggior parte della radioattività dei fagi marcati con ³²P risultò associata ai batteri, mentre solo una piccola parte della radioattività ³⁵S era presente nelle cellule infette. → I fagi dovevano aver trasferito il loro DNA all'interno dei batteri.

RNA come materiale genetico

Alcuni virus però contengono RNA anziché DNA. Nel 1956 fu dimostrato che quando l'RNA purificato dal virus TMV veniva diffuso sulle foglie di tabacco, successivamente su queste apparivano le caratteristiche lesioni causate dall'infezione virale. Altri virus a RNA sono i retrovirus. Il loro RNA viene utilizzato come stampo per la sintesi di una molecola di DNA complementare (trascrizione inversa), processo che avviene sotto la direzione della trascrittasi inversa. Questo DNA intermedio può essere quindi incorporato nel genoma della cellula ospite e quando il DNA ospite viene trascritto, vengono prodotte copie dei cromosomi RNA retrovirali originali. Sono retrovirus l'HIV e diversi virus tumorali.

Struttura del DNA e dell'RNA

Il DNA e l'RNA sono acidi nucleici i cui blocchi costitutivi sono rappresentati dai nucleotidi, monomeri a loro volta formati da:

• Una base azotata – purina (doppio anello con 9C) o pirimidina (singolo anello con 6C). Due tipi di purine: adenina e guanina. Tre tipi di pirimidine: citosina, timina e uracile.
• Uno zucchero pentoso – desossiribosio (DNA) o ribosio (RNA).
• Un gruppo fosfato – legato all'atomo C-5'.

Nucleoside: molecola composta da una base e uno zucchero pentoso, manca il gruppo fosfato. L'assenza di un gruppo ossidrilico nella posizione C-2' distingue il DNA dall'RNA e lo zucchero viene quindi chiamato 2-desossiribosio. Le purine (A e G) sono contenute sia da DNA che da RNA. Solo il DNA contiene la T e solo l'RNA la U, entrambi la C.

Due nucleotidi si legano tramite il legame fosfodiestere: legame covalente tra il gruppo fosfato di un nucleotide e il C-3' dello zucchero di un altro nucleotide. Fosfodiestere perché l'acido fosforico è unito a due alcoli da un legame estere su entrambi i lati. Le catene corte composte da un massimo di 30 nucleotidi sono chiamate oligonucleotidi, catene più lunghe sono polinucleotidi. Ogni struttura ha un'estremità C-5' a cui è legato un gruppo fosfato e un'estremità C-3' in cui è presente un idrossile OH.

Modello a doppia elica del DNA

La struttura a doppia elica del DNA fu proposta nel 1953 da Watson e Crick, che si basarono sull'analisi della composizione di base di campioni idrolizzati e studi di diffrazione di raggi X del DNA. Tra il 1949 e il 1953, Chargaff e i suoi colleghi usarono metodi cromatografici per separare le quattro basi nei campioni di DNA da vari organismi e utilizzando metodi quantitativi determinarono le quantità delle quattro basi di ciascun organismo. Chargaff concluse che la quantità di residui di adenina è proporzionale alla quantità di residui di timina e la quantità di residui di guanina è proporzionale a quella di citosina. Sulla base di questa proporzionalità (A=T e G=C), la somma delle purine (A+G) è uguale alla somma delle pirimidine (C+T). Tuttavia la percentuale di (G+C) non corrisponde necessariamente alla percentuale di (A+T), questo rapporto varia notevolmente tra gli organismi. Con questi dati confutò l'ipotesi del tetranucleotide di Levene secondo la quale le quattro basi dovevano essere presenti in quantità uguali.

Quando le fibre di una molecola di DNA sono soggette a bombardamento di raggi X, questi si disperdono per diffrazione secondo un pattern che dipende dalla struttura atomica della molecola. Il modello di diffrazione può essere catturato su una pellicola fotografica per essere analizzato, come fecero Linus Pauling e altri chimici. La tecnica era già stata tentata da Astbury, rivelando una periodicità di 3,4 angstrom all'interno della struttura della molecola, il che suggeriva che le basi fossero sovrapposte come monete l'una sopra l'altra. Rosalind Franklin ottenne dati radiografici migliori da campioni di DNA purificati, confermando la periodicità di 3,4 Å e suggerì che la struttura fosse una sorta di elica.

Nel 1953, Watson e Crick, costruendo modelli basati sui parametri precedentemente ottenuti, giunsero a proporre il modello a doppia elica. L'associazione A-T e C-G di Chargaff poteva verificarsi come risultato dei legami idrogeno tra coppie di basi, struttura che fornirebbe la stabilità chimica necessaria a tenere insieme le due catene.

Organizzazione del DNA nei cromosomi

Proprietà del modello a doppia elica:

• Due catene polinucleotidiche si avvolgono in senso orario in una doppia elica destrorsa.
• Le catene di nucleotidi sono antiparallele: una 5' → 3', l'altra 3' → 5'.
• I filamenti di zucchero-fosfato sono esterni e le basi orientate verso l'asse centrale. Questa disposizione conferisce grande stabilità: le basi idrofobiche sono schermate dall'ambiente acquoso esterno, con cui interagisce invece il filamento idrofilico.
• Coppie complementari di basi di fili opposti sono unite da legami idrogeno → tengono insieme le due catene. A forma due legami idrogeno con T, G ne forma tre con C.
• Le coppie di basi distano 0,34 nm. Un giro completo dell'elica richiede 3,4 nm (10 basi). Il diametro è di 20 Å.
• I filamenti di zucchero-fosfato non sono spaziati equamente, con conseguenti solchi maggiori e minori, nei quali avviene l'interazione tra varie proteine e sequenze specifiche del DNA.

In particolari condizioni di isolamento si osservano diverse conformazioni del DNA. L'analisi di Watson e Crick si basava sugli studi a raggi X di Rosalind Franklin sulla forma B, che si osserva in condizioni acquose a bassa concentrazione di sali e si ritiene che sia la conformazione biologicamente significativa. Con tecniche moderne è stata descritta la forma A-DNA che si riscontra in condizioni di alto contenuto di sale o disidratazione. È leggermente più compatta della forma B, con 9 coppie di basi ad ogni giro e un diametro di 23 Å (2,3 nm). Dubbiamente l'A-DNA si presenta in vivo.

Nel 1979 fu scoperta la forma Z-DNA, con andamento sinistrorso, diametro di 18 Å, 12 coppie di basi per giro e una conformazione a zig-zag. Se ne specula l'esistenza in vivo. Durante la replicazione e la trascrizione i filamenti dell'elica devono separarsi e diventare accessibili a grandi enzimi e altre proteine. È possibile che i cambiamenti nella forma del DNA facilitino tali funzioni.

Il genoma

Genoma: intero contenuto della sequenza di DNA di un organismo (DNA nucleare). Tutto il DNA di un organismo è organizzato in uno o più cromosomi. I cromosomi di virus e batteri sono molto meno complicati di quelli degli eucarioti. Di solito sono costituiti da una singola molecola di acido nucleico abbastanza diversa dai cromosomi multipli degli eucarioti. I cromosomi procariotici sono in gran parte privi di proteine associate e contengono relativamente meno informazioni genetiche.

I cromosomi virali sono costituiti da una molecola di acido nucleico (DNA o RNA) che può essere a filamento singolo o doppio. Possono rimanere lineari o formare strutture circolari. I cromosomi batterici sono sempre costituiti da una molecola di DNA a doppio filamento, compattata in una struttura denominata nucleoide. Il DNA nei cromosomi batterici si trova associato a diversi tipi di proteine. Due di queste, HU e H1, sono piccole ma abbondanti nella cellula e contengono un'elevata percentuale di aminoacidi carichi positivamente che possono quindi legarsi ionicamente alle cariche negative dei gruppi fosfato del DNA. Queste proteine sono strutturalmente simili agli istoni eucariotici, ma non sono coinvolte nella compattazione del DNA.

Cromatina e nucleosomi

Cromatina: complesso di DNA e proteine cromosomiche (il doppio di quelle del DNA). Due principali tipi di proteine:

• Istoni: proteine basiche abbondanti, con carica positiva, che si legano al DNA. Cinque tipi principali: H1, H2A, H2B, H3, H4. Massa uguale a quella del DNA. Conservati evolutivamente. Svolgono ruolo strutturale perché contengono numerosi amminoacidi carichi + (arginina e lisina), grazie ai quali si legano ai gruppi fosfatici di nucleotidi carichi –. Possono subire modificazioni (che li rendono meno carichi): fosforilazione, metilazione, acetilazione, poli(ADP) ribosilazione.
• Non-istoni: differiscono ampiamente in tipologia e struttura. Quantità molto variabile (tra il 50% e il 100% della massa del DNA). Acetilazione: modificazione degli istoni per azione dell'enzima istone acetiltransferasi (HAT). L'aggiunta di un gruppo acetilico al gruppo aminico caricato positivamente presente sulla catena laterale dell'amminoacido lisina, neutralizza la carica positiva. Alti livelli di acetilazione aprono o rimodellano la fibra di cromatina, meccanismo coinvolto nell'attivazione genica.

Durante la mitosi, il DNA dei cromosomi eucariotici è organizzato in strutture altamente condensate e chiaramente visibili. Dopo la separazione dei cromosomi e la divisione cellulare, le cellule entrano nello stadio di interfase e i componenti del cromosoma decondensano in eucromatina, che viene dispersa in tutto il nucleo. Man mano che il ciclo avanza, le cellule possono replicare il loro DNA e rientrare in mitosi, dopodiché la cromatina si avvolge e si condensa nuovamente in cromosomi visibili, determinando una contrazione della lunghezza di 10.000 volte per ogni fibra di cromatina.

Le fibre di cromatina sono composte da matrici lineari di particelle sferiche (collana di perle). Queste particelle sono chiamate nucleosomi e sono costituite da due tetrameri, ciascuno formato dagli istoni H2A, H2B, H3 e H4 che danno origine a un ottamero (→ 8 istoni). Un tratto di DNA di 146 coppie di basi compie due avvolgimenti attorno ad un nucleosoma. La formazione del nucleosoma rappresenta il primo livello di impaccamento, per cui l'elica del DNA è ridotta a circa un terzo della sua lunghezza avvolgendosi attorno agli istoni.

Nel nucleo, la cromatina non è quasi mai in forma estesa a collana di perle, infatti viene ulteriormente impacchettata in una struttura di diametro di 30 nm (prima erano 11), solenoide. Questo secondo livello di impaccamento dipende dalla presenza dell'istone H1. Nelle fibre di cromatina quindi, il DNA è inaccessibile all'interazione con importanti proteine non istoniche, come quelle che hanno ruoli enzimatici e regolatori durante i processi di replicazione e trascrizione. La cromatina deve quindi cambiare struttura, in un processo chiamato rimodellamento della cromatina, ma deve anche essere in grado di invertire il processo durante i periodi di inattività.

Nella transizione verso il cromosoma mitotico, si verifica un'ulteriore compattazione: le strutture da 30 nm sono piegate in una serie di anelli, condensando in una nuova struttura dal diametro di 300 nm. L'impalcatura per gli anelli è conferita da proteine non istoniche. Queste fibre di cromatina vengono quindi compattate nei bracci cromosomici che costituiscono un cromatide, una delle subunità longitudinali del cromosoma metafasico. Una cellula umana immagazzina tutto il suo materiale genetico in un nucleo di circa 5-10 µm di diametro. Il genoma aploide contiene oltre 3 miliardi di paia di basi distribuite tra 23 cromosomi; la cellula diploide ne contiene il doppio → il DNA è lungo quasi due metri.

Nella transizione complessiva da un'elica di DNA al cromosoma mitotico, si raggiunge un rapporto di impacchettamento di 500:1. Durante l'interfase, il 10-30% del cromosoma rimane condensato (eterocromatina), mentre la maggior parte si decondensa in eucromatina. Le aree eterocromatiche sono geneticamente inattive (mancano di geni o contengono geni repressi). Inoltre, l'eterocromatina si replica più tardivamente durante la fase S del ciclo cellulare rispetto all'eucromatina.

Si ritiene che una particolare regione eterocromatica del cromosoma, il telomero, sia coinvolta nel mantenimento dell'integrità strutturale del cromosoma e un'altra regione, il centromero, sia coinvolta nel movimento cromosomico durante la divisione cellulare. In alcuni casi, cromosomi interi sono eterocromatici: è il caso del cromosoma Y, in gran parte geneticamente inerte, e del cromosoma X inattivato nelle femmine di mammiferi, che è condensato in un corpo di Barr eterocromatico inerte.

Tipi di eterocromatina

• Costitutiva: compatta durante tutti gli stadi di sviluppo e in tutti i tessuti. DNA permanentemente silenziato – le citosine sono metilate. Sequenze altamente ripetute (DNA satellite) ricche in A-T. Altamente variabili in taglia e posizione, senza effetti fenotipici. Si ripiegano su se stesse e possono avere un ruolo nella formazione delle strutture.