Epigenetica appunti lezione

Epigenetica 2020

Regolazione dell'espressione genetica nei procarioti

I procarioti sono i batteri che hanno il nucleoide, quindi hanno il DNA libero nel citoplasma. Hanno un unico cromosoma circolare dove sono racchiusi i geni che codificano per proteine. L’operone è un gruppo di geni strutturali codificanti per proteine con funzioni correlate (es. coinvolte nella stessa via metabolica) sottoposti ad una regolazione unica e coordinata. Sono indotti o repressi dal prodotto di un gene regolatore, distinto dai geni strutturali. Es. operone Lac.

L'operatore (=sequenza di controllo) è una sequenza di DNA interposta tra il promotore e il primo dei geni strutturali. Ci sono due tipi di operone nei procarioti:

• Operone inducibile: il repressore da solo è in forma attiva e si lega all’operatore impedendo la trascrizione. Il legame con il corepressore fa staccare dall’operatore il repressore, rendendo accessibile il promotore alla RNA polimerasi e consentendo la trascrizione.
• Operone reprimibile: il repressore da solo è in forma inattiva e non è in grado di legarsi all'operatore, il promotore è accessibile alla RNA polimerasi e quindi vi è trascrizione. In presenza di corepressore-repressore legati all’operatore vi è il blocco della trascrizione.

Un esempio di operone inducibile è l’operone Lac di E. Coli, che è stato descritto per la prima volta da Jacob e Monod qualche anno dopo la scoperta dell'mRNA. Questo comprende geni strutturali LacZ, l’operatore e il gene regolatore. A livello di promotore c’è il sito di legame della RNA polimerasi e a monte il sito di legame con la proteina cAMP-CRP.

I tre geni strutturali descritti da Jacob e Monod codificano per tre enzimi: LacZ codifica per la B-galattosidasi, LacY codifica per una permeasi, LacA codifica per una transacetilasi. Questi enzimi consentono al batterio di utilizzare il lattosio come fonte di energia. In assenza di corepressore (allolattosio), il repressore è attivo, lega l’operatore e la sintesi degli enzimi è repressa. Quando la cellula utilizza lattosio come fonte di energia (è presente allolattosio): il repressore si stacca dall’operatore, l’RNA polimerasi si lega al promotore e sintetizza l’mRNA policistronico che codifica per i tre enzimi che fanno sì che la cellula usi il lattosio.

Un esempio di operone reprimibile è l’operone trp (triptofano) che presenta però il fenomeno chiamato dell'attenuazione trascrizionale, cioè la regolazione della fine della trascrizione dell’mRNA, coinvolta nel controllo dell’espressione di alcuni operoni batterici. È ben conosciuta nella trascrizione dell’operone triptofano. Se nella cellula la quantità di triptofano è sufficiente, la trascrizione si arresta in corrispondenza di un tratto di DNA, chiamato attenuatore, producendo un frammento molto piccolo di mRNA che non codifica tutti i geni necessari alla sintesi del triptofano. La trascrizione riprende normalmente quando la concentrazione di triptofano risulta insufficiente.

Regolazione espressione genica negli eucarioti

Tale regolazione è diversa dalla precedente per tre motivi principalmente:

• Negli eucarioti è presente la regolazione dell’espressione spazio-temporale.
• È presente il fenomeno del differenziamento: cellule con genoma identico, si specializzano morfologicamente e funzionalmente attivando o reprimendo l’espressione di geni specifici.
• L’espressione di un gene eucariotico (dal DNA alla proteina) prevede molti più stadi a differenza dei procarioti, ognuno regolato.

Esperimento di Gurdon (1962): il nucleo di una cellula somatica di anfibio (X. Laevis) venne trasferito all’interno del citoplasma di un ovocita precedentemente enucleato. Si sviluppò l’anfibio adulto. Questo esperimento ha dato il via alla clonazione animale. Il DNA nucleare contiene l’intero corredo di geni necessario per generare un organismo completo.

Esperimento di Wilmut e Campbell: la pecora Dolly (1996-97): come abbiamo già detto, quindi, la regolazione degli eucarioti avviene secondo più step, in particolare sei:

• Controllo a livello genomico (variazione di un numero di copie di un gene, CNV). L’esempio che facciamo è quello dell’ovocita di anfibio. Qui i geni che codificano per i precursori del rRNA, sono presenti in un numero di copie circa 1000 volte in più delle cellule somatiche dell’anfibio. L’ovocita dell’anfibio presenta una ridondanza di nucleoli perché è necessaria una massiccia sintesi proteica durante l’embriogenesi. L’ rDNA in eccesso risiede quasi tutto in nucleoli extracromosomici.
• Modulazione dello stato della cromatina (eucromatina ed eterocromatina). I geni attivi adottano una conformazione della cromatina più “aperta” per l’accesso della RNA polimerasi (cromatina con una conformazione meno condensata, quindi decondensata).
• Le regioni regolative dei geni hanno bassa densità nucleosomica. I fattori di trascrizione sono in grado di reclutare enzimi che modificano gli istoni e i fattori di rimodellamento della cromatina. La decondensazione della cromatina consente la trascrizione di quei geni che si trovano nella cromatina.
• In questa immagine si notano dei puff (=rigonfiamenti della cromatina che rappresentano zone di decondensazione della cromatina e siti trascrizionalmente attivi). I cromosomi politecnici di drosophila sono cellule delle ghiandole salivari (stadio pre-pupale) dove avviene la replicazione del DNA ma non si separano i cromatidi fratelli (no segregazione). Sono molto grandi, ogni cromosoma è costituito fino a 1024 cromatidi fratelli.

Questo fenomeno della decondensazione della cromatina ci porta alla definizione di epigenetica, ovvero l’insieme di modificazioni chimiche di DNA e istoni che hanno effetti sulla trascrivibilità della cromatina senza modificazione delle sequenze di DNA. La più importante modifica a carico del DNA è la metilazione. Nel regno animale la metilazione delle citosine è essenzialmente limitata alle citosine in un contesto CpG. Circa il 70-80% del genoma è costituito di nucleotidi CpG.

Il gruppo metile alla citosina lo aggiunge la classe di enzimi DNMT (famiglia di quattro enzimi: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L). DNMT1 è quello principale ed è il responsabile del mantenimento della metilazione del DNA. Gli altri tre sono responsabili della metilazione de novo. Le CpG islands indicano il legame fosfodiestere tra i due nucleotidi C-G. Sono lunghe tra le 200-2000 basi e in quella lunghezza almeno la metà è C-G.

Nel genoma ce ne sono 29000 di isole e generalmente sono localizzate a livello del promotore dei geni, e se sono ipermetilate (citosine tutte metilate) allora quel gene è silenziato, se invece le citosine sono demetilate allora il gene è attivamente trascritto. Nei tumori assistiamo a una disregolazione di metilazione del profilo di determinati geni. La cellula utilizza la metilazione per controllarne il livello di espressione, ma quando la cellula si allontana da questa condizione fisiologica, allora ci avviciniamo a condizioni patologiche, incluso il cancro.

Nei tumori troviamo i “tumors suppressor gene” che sono i geni che controllano per esempio il livello di replicazione cellulare. Esiste inoltre un’altra classe di geni, gli oncogeni che sono gli acceleratori stimolando la replicazione. La diregolazione di questi geni fa sì che una cellula diventi tumorale. La metilazione è un processo reversibile, ci sono enzimi che metilano una citosina ma anche enzimi che la demitilano.

Il ruolo naturale della metilazione del DNA nei mammiferi si riversa su alcuni fenomeni:

• Imprinting
• Inattivazione cromosoma X
• Mantenimento eterocromatina
• Controllo dello sviluppo
• Controllo espressione tessuto specifico

Nelle cellule germinali (gameti), vi è un livello di metilazione più basso rispetto all’embrione o alle cellule somatiche degli adulti. L’imprinting è il profilo di metilazione specifico e diverso tra la copia paterna e quella materna di alcuni geni.

Un dato gene è soggetto ad imprinting quando uno dei due alleli, ma sempre lo stesso in tutti gli individui di una data specie, viene silenziato tramite metilazione delle citosine e rimane stabile per l’intera vita dell’organismo. Nell’uomo circa 100 geni sono soggetti ad imprinting. Es. IGF2 (fattore di crescita fetale), nell’uomo si esprime solo l’allele paterno. È silenziato l’allele materno (perché il promotore di tale gene è ipermetilato).

Patologie umane associate a difetti di imprinting

• Diabete mellito neonatale transiente
• Sindrome di wang
• Sindrome di angelman
• Sindrome di mussel-silver
• Sindrome di beckwith-wiedemann
• Sindrome di prader-willi

Possiamo ora, dopo aver descritto metilazione e imprinting, fare dei cenni alle tecniche che si usano in laboratorio per studiare i livelli di metilazione del DNA:

• La prima tecnologia è l’analisi della metilazione del DNA basata su enzimi di restrizione sensibili o meno alla metilazione (MSRE): sono enzimi che sono in grado o meno di tagliare il DNA a seconda se è metilato o meno.
• Conversione del DNA con il bisulfito: composto che trasforma la citosina demitilata in uracile. Se invece la citosina è metilata il bisulfito non modifica la citosina. Applicabile nel sequenziamento per capire quale è il tasso di metilazione di un promotore o di un gene (contando quante C diventano U).
• Tecnologia cobra: tecnologia che combina il trattamento del DNA con il bisulfito e l’utilizzo di enzimi di restrizione. Il DNA quindi viene trattato con il bisulfito e poi viene amplificato con la tecnologia della PCR (si scelgono delle coppie di primer che stanno ai margini della porzione di DNA di cui si vuole conoscere il livello di metilazione. I primer in se non contengono CpG, perché questi stanno all’interno della porzione amplificata). Una volta che il frammento è stato amplificato, viene sottoposto al taglio di enzimi che contengono nel sito di restrizione il sito C-G (se non c’è non c’è taglio). Generando così più frammenti di restrizione. Per distinguere la lunghezza dei frammenti si carica il tutto su un gel d’agarosio.