Biochimica clinica

Biochimica clinica

La biochimica clinica è lo studio in campioni biologici provenienti dall’uomo (sangue, urine, feci, …) o nell’uomo stesso (es: risonanza magnetica) di parametri chimico-fisici e chimici che possono fornire informazioni sui processi fisiologici e/o patologici allo scopo di predire, diagnosticare o monitorare lo stato di malattia.

Definizione di finestra fisiologica

Si definisce una finestra fisiologica (es: valori di riferimento dell’emocromo). Nello stesso soggetto possono essere effettuati confronti tra diverse analisi svolte successivamente nel corso del tempo, per vedere se nel tempo un parametro aumenta oppure diminuisce. Valutazione delle modificazioni dei parametri biochimici con definizione degli scostamenti dalla media.

• Fornisce informazioni ottenute con metodi chimici, fisici o biologici su tessuti, liquidi biologici o su materiali connessi alla patologia.
• Differenza tra biochimica e biochimica clinica:

La biochimica studia le vie metaboliche valutando il comportamento di proteine, enzimi, elementi chimici e cellulari nei fenomeni fisiologici e patologici ricavando comportamenti e leggi.

La biochimica clinica studia i processi patologici e utilizza la misura delle eventuali alterazioni di proteine, enzimi, elementi chimici e cellulari, riscontrabili nei campioni biologici per raccogliere dati e informazioni che servono a confermare o meno l’ipotesi diagnostica del clinico.

È il settore della medicina di laboratorio in cui le conoscenze biochimiche vengono utilizzate per la caratterizzazione di processi patologici.

Caratteristiche della biochimica clinica

La biochimica clinica è una disciplina sperimentale che nasce in laboratorio. Si basa sulla ricerca pura e sulla ricerca applicata. Può essere condotta in vivo e in vitro.

Viene utilizzata per:

• Diagnosticare la presenza di malattie
• Monitorare la terapia
• Cercare le basi molecolari delle malattie

La biochimica clinica negli ultimi anni sta cambiando radicalmente. Modello brain-to-brain descritto da Lundberg nel 1981 descrive il rapporto tra il biochimico clinico e la medicina, ovvero un supporto alle attività cliniche. Il “vero” cervello veniva ritenuto quello del medico che prescrive l’analisi, il biochimico clinico è colui che fornisce il dato.

Importanza crescente della medicina di laboratorio

Negli ultimi anni, la medicina di laboratorio sta diventando sempre più importante. La medicina si sta spostando sempre di più verso una medicina di precisione → approccio olistico che tiene conto sia della condizione del paziente, ma anche dell’ambiente, dello stile di vita, dell’alimentazione, della variabilità di risposta alla terapia, …

Questo approccio è di tipo multi-disciplinare, è necessario un team che collabora insieme.

Le 4P della medicina di precisione

1. Predittiva
2. Preventiva
3. Partecipativa
4. Personalizzata

Diventa fondamentale l’esame di laboratorio per acquisire informazioni nel paziente asintomatico e per identificare i fattori di rischio nel soggetto “sano” e modificare la storia naturale della patologia.

Processo diagnostico

Il paziente avverte un problema di salute e si reca dal medico (di base o specialista), il quale farà un’anamnesi. Il medico fa anche un esame obiettivo e prescrive degli esami diagnostici per confermare la sua ipotesi. L’analisi e la consegna del referto sono compiti del biochimico clinico. Il trattamento al quale viene sottoposto il paziente viene deciso in team. Il paziente viene monitorato nel tempo mediante dei follow-up.

Oltre al cervello del medico, sono essenziali il cervello del laboratorio clinico sia per l’analisi che la refertazione e il cervello del paziente.

Cambiamenti nel processo diagnostico di laboratorio

Un altro cambiamento è relativo anche ai diversi step che definiscono il processo diagnostico di laboratorio:

1. Fase iniziale, la cosiddetta fase pre pre-clinica che avviene ancora prima che il campione arrivi nel lab clinico.
2. Fase pre-clinica interna al laboratorio, è dedicata a predisporre il campione per l’analisi.
3. Fase intra-clinica che consiste nell’analisi.
4. Fase post-analitica che consiste nella validazione dei risultati e nella trasmissione del risultato.
5. Fase finale post post-analitica che va dal momento in cui il clinico prende in carico i risultati dal laboratorio al momento in cui queste informazioni vengono interpretate e utilizzate nel processo diagnostico e terapeutico.

Obiettivi clinici del processo diagnostico

• Predire la suscettibilità alle malattie mediante l’identificazione di fattori di rischio correlati con lo sviluppo di una patologia.
• Prevenire le malattie, identificando fattori di rischio che possono portare a modifiche dello stile di vita o altre tipologie di interventi clinici.
• Diagnosticare le patologie, preferenzialmente nelle fasi iniziali dove le possibilità di cura sono migliori. Analisi di campioni in cui sono presenti dei marker dello sviluppo della patologia.
• Determinare la prognosi.
• Monitorare lo sviluppo delle malattie, identificando l’efficacia dei trattamenti e valutando possibili modifiche.
• Personalizzare la terapia per ottenere migliori risultati clinici, riducendo il rischio di eventi avversi.

Tipi di analisi e campioni biologici

Le analisi possono essere di due tipi: di routine (biochimica clinica, ematologia e coagulazione, biologia molecolare clinica, microbiologia, virologia, immunologia, dosaggi ormonali, immunotrasfusione) oppure d’urgenza. I tipi di campioni biologici sono vari, i principali sono:

• Sangue (venoso, arterioso, capillare)
• Urine
• Feci
• Liquidi biologici come il liquor, lo sperma, il liquido pleurico, etc.
• Liquido amniotico e villi coriali

Fasi del processo diagnostico in laboratorio

• Fase pre-pre-analitica: Selezione dei test.
• Fase pre-analitica: Richiesta e prelievo.
• Fase analitica: Accettazione: operazioni tecniche necessarie per estrapolare dal campione biologico prelevato il tipo o sottotipo cellulare su cui occorre effettuare le indagini. Effettuazione delle indagini di laboratorio.
• Fase post-analitica: Interpretazione del risultato e refertazione. Errori in questi processi fanno sì che l’analisi non sia più correlabile con il dato ottenuto.

Inizio del processo diagnostico

Il processo diagnostico ha inizio dal cervello del medico. Il medico, a seguito dell’anamnesi, ipotizza la diagnosi di una patologia → nella maggior parte dei casi deve essere correlata con un dato qualitativo/quantitativo osservabile. A questo punto seleziona gli esami da fare e fa una prescrizione. Il campione viene raccolto e identificato in modo tale da essere correlato al paziente, poi viene trasportato in laboratorio. Avviene l’accettazione del campione, il processamento, l’analisi e la refertazione. Il medico interpreta il risultato e conferma o meno l’ipotesi diagnostica, in base alla quale prescriverà la terapia.

Errori del processo diagnostico

Nelle fasi pre- e post-analitiche si determina il maggior rischio di errore, che rappresenta oltre l’80%. Le tecnologie hanno ridotto molto la possibilità di errore nella fase analitica → esistono numerosi standard di riferimento, in questo modo le analisi svolte in luoghi diversi sono perfettamente comparabili. Gli errori cognitivi sono legati al ragionamento clinico. Portano a errori nella richiesta dell’esame appropriato da fare, possono essere legati a una carente interpretazione dei risultati o alla mancata presenza di informazioni cliniche disponibili. Gli errori di sistema si generano dall’implementazione delle procedure e dei processi che costituiscono il ciclo dell’esame di laboratorio, possono essere minimizzati attraverso lo sviluppo e tramite il monitoraggio di alcuni sistemi di qualità.

Fase pre-clinica

Il materiale biologico deve essere etichettato, o con un barcode o con un pennarello indelebile. Il campione prelevato deve essere conforme all’analisi richiesta. Per eseguire le analisi biochimiche è necessario che il laboratorio venga fornito del campione, siglato e raccolto in maniera idonea in relazione all’esame richiesto e del modulo di richiesta dettagliato e interamente compilato. È importante verificare:

• L’idoneità del campione → deve essere stato prelevato e conservato in maniera adeguata
• La corretta compilazione della richiesta
• La corrispondenza campione-richiesta

La fase pre-clinica comprende:

1. La preparazione del paziente: Il paziente deve essere correttamente informato sull’analisi che si sta compiendo.
2. Scelta del materiale per la raccolta
3. Raccolta del campione biologico
4. Conservazione e trasporto del campione
5. Preparazione del campione all’analisi (centrifugazione, separazione, congelamento, identificazione)

Importanza del trattamento corretto del campione

Questa fase è importante:

• Qualitativamente: L’utilità clinica del dato è legata a un corretto trattamento del campione biologico. Le fasi di trattamento del campione devono essere altamente accurate e standardizzate in modo tale da ridurre l’errore il più possibile. È importante la riproducibilità.
• Quantitativamente: La pre-analisi costituisce il 57% del turnaround time, rappresenta la parte più lunga del processo di analisi.

Prelievo di sangue

Le analisi del sangue sono le analisi più comuni e routinarie di biochimica clinica. Tutte le fasi sono fondamentali affinché si ottengano dei risultati validi e correlabili alla condizione patologica.

Fasi preliminari

1. Preparazione del paziente: Il paziente va guidato all’accesso alla sala prelievi. Per gli esami del sangue, generalmente è richiesto un digiuno di almeno 8-12 ore, ma il paziente deve comunque assumere i farmaci (a esclusione di casi particolari come il breath test, le eccezioni devono essere comunicate precedentemente al paziente). Il paziente deve essere correttamente informato sulle modalità di raccolta del campione. Vanno spiegate le modalità di raccolta di urine e feci e le modalità di esecuzione dei prelievi più invasivi, come possono essere i tamponi.
2. Elenco delle analisi da seguire: Le analisi devono essere svolte sotto prescrizione del medico di base o del medico specialista. L’elenco delle analisi da seguire può avvenire mediante impegnativa da parte del medico curante, mediante richiesta diretta a un sistema informatico dedicato oppure mediante richiesta manuale.
3. Identificazione del paziente mediante riconoscimento manuale o con etichetta di prelievo: Il paziente deve essere riconosciuto in maniera accurata e specifica. I dati che devono essere riportati per l’identificazione del paziente sono: dati anagrafici del paziente (cognome e nome), identificativo del laboratorio (protocollo), descrizione del contenitore, data del prelievo ed eventuali altri dati utili (es: reparto, provenienza, etc.)
4. Raccolta nel materiale necessario: Un aspetto importante è la protezione individuale, è necessario utilizzare guanti che proteggono sia operatore sia consentono di evitare la contaminazione del campione.

Importanza del digiuno e del riposo

L’esame del sangue viene effettuato la mattina dopo 8-12 ore di digiuno in modo tale da poter valutare i valori basali → è importante non solo per la valutazione di quei parametri che possono essere modificati dall’assunzione di zuccheri, ma in generale perché in questo modo il plasma sia limpido e non contenga lipidi che possono alterare le analisi.

Il prelievo ideale deve avvenire a riposo, in quanto l’esercizio fisico altera numerosi parametri soprattutto a livello ormonale (anche ansia/stress può alterare). La quantità di volume plasmatico quando il paziente è allettato/sdraiato (clinostatismo) oppure in posizione eretta (ortostatismo), cambia notevolmente → variazione fino a 400 ml.

L’utilizzo del laccio emostatico ha lo scopo di favorire l’aumento della pressione a livello delle vene in modo da agevolare l’effettuazione del prelievo. L’uso prolungato del laccio può però causare variazioni importanti di alcuni parametri come l’ematocrito (emoconcentrazione) e la potassiemia (incremento). Può anche causare stasi, ossia un aumento della pressione idrostatica determina la fuoriuscita di liquidi verso il compartimento extravascolare con un aumento di concentrazione proteica e delle sostanze a esse legate (ormoni, farmaci, calcio, …).

Il prelievo deve essere eseguito prima dell’assunzione di farmaci che potrebbero influenzare la concentrazione di vari parametri. Alcuni prelievi vengono eseguiti proprio per la misurazione dei livelli di farmaci (digossina, anti-epilettici).

Criticità tecniche

• Sequenza delle provette nel prelievo
• Corretto riempimento delle provette
• Omogenizzazione del campione
• Tempo per la formazione del coagulo
• Condizioni di centrifugazione → esempio: se si vuole lavorare sul siero, si deve eliminare il coagulato
• Conservazione dei campioni

Il sangue

È il campione biologico sul quale vengono effettuate la maggior parte delle analisi. Funzioni: ossigenazione dei tessuti, difesa immunitaria, emostasi, trasporto di nutrienti/ormoni/elettroliti/gas/metaboliti/enzimi/… In un soggetto di 70 kg il volume di sangue è di 5/6 litri. Può essere venoso, arterioso o capillare. Può essere analizzato come sangue intero, come plasma o come siero. Nel sangue è possibile cercare marker di numerose patologie, questi possono essere riversati dai tessuti nel torrente circolatorio dove possono essere facilmente detectati mediante analisi specifiche quando sono al di sopra di una certa soglia:

• Sangue intero: presente sia parte corpuscolata che liquida (plasma).
• Siero: il sangue viene fatto coagulare nella provetta e viene rimosso il coagulo, ciò che resta è siero.
• Plasma: sangue intero al quale viene aggiunto un anti-coagulante che fa sì che i fattori della coagulazione rimangano in soluzione e non formino il coagulo. Il plasma è sangue intero privato della parte cellulare mediante centrifugazione, permette di studiare i fattori della coagulazione in quanto rimangono in soluzione.

Il prelievo

Il primo step è l’applicazione del laccio emostatico, che permette di facilitare la visualizzazione della vena. Deve essere posto circa 10 cm sopra la zona prescelta per il prelievo. Non bisogna stringere troppo e non bisogna lasciarlo troppo legato al braccio. Il prelievo di solito è di tipo venoso e viene effettuato a livello della vena cubitale mediana (vena grossa, il prelievo potrebbe essere fatto anche a livello delle vene dorsali delle mani e dei piedi, ma sono più fragili). Bisogna inclinare il braccio del paziente verso il basso, fare chiudere e aprire il pugno al paziente e picchiettare sulla zona prescelta.

Il prelievo capillare viene effettuato sui neonati o in caso di digito-punture effettuate a domicilio, in farmacia oppure fai da te (effettuate per la misurazione della glicemia o del colesterolo). È necessario massaggiare bene la zona da pungere (magari con una garza imbevuta di disinfettante), pungere con il pungidito e lasciare fluire spontaneamente il campione o esercitare leggere compressioni intorno alla puntura. È importante evitare la fuoriuscita di liquido extra-cellulare che può inficiare la qualità pre-analitica del campione.

Il sangue arterioso presenta le stesse caratteristiche a livello di tutti i distretti del corpo. Il prelievo arterioso è abbastanza invasivo, viene effettuato a livello dell’arteria radiale (vicino al polso) o femorale. Questo prelievo viene utilizzato per fare analisi sull’equilibrio acido-base. È più soggetto a ematomi e dolabilità. È fondamentale la disinfezione cutanea pre- (elimina contaminanti) e post-prelievo. Tutte le provette vanno miscelate (4-6 volte) al fine di solubilizzare gli additivi presenti nel contenitore. La miscelazione deve essere delicata, al fine di non causare lisi delle emazie. Il materiale ematico prelevato deve giungere nel più breve tempo possibile presso il laboratorio di analisi. Più il materiale attende, più il risultato analitico è alterato. L’emogas permette di misurare alcuni parametri diagnostici come i livelli circolanti di ossigeno, anidride carbonica oppure il pH: è importante che venga analizzato subito. In generale, tutti i materiali ematici vengono conservati e trasportati a 2-8 °C.

Errori durante il prelievo

Principali errori che possono avvenire durante un prelievo: la vena viene mancata oppure viene oltrepassata, l’ago viene depositato sulla parete della vena, avviene l’arresto del flusso di sangue e la formazione di un ematoma. Per il prelievo si utilizza un ago di un certo calibro, collegato a un tubicino che si connette alle provette.

Provette

Le provette non sono tutte uguali, vengono identificate da un tappo di colore diverso. È presente un’etichetta che descrive cosa è presente nella provetta e il tipo di campione che deve essere contenuto. Si utilizza una provetta diversa a seconda se le analisi devono essere effettuate su siero o plasma.

• Siero: provette senza additivi o con additivi attivanti la coagulazione.
• Plasma: provette contenenti anti-coagulanti (EDTA, citrato, eparina, …).

Le provette sono sterili e possono essere di vetro o plastica. Hanno un tappo di gomma colorato che permette una chiusura sottovuoto → in questo modo la quantità di sangue prelevata è fissa e predeterminata, ciò è importante per la miscelazione con gli additivi presenti nella provetta. Questo permette anche di evitare il contatto del paziente o dell’operatore con il sangue.

Principali provette utilizzate:

• Azzurro: contiene sodio-citrato, vengono usate quando si vuole monitorare la coagulazione.
• Rosso o giallo/oro: con o senza attivatori della coagulazione, vengono utilizzate quando si vuole analizzare il siero (esame sierologico, immunologico).
• Verde: contengono sodio o litio eparina (anti-coagulante, viene inibita la trombina).
• Viola o rosa: contengono EDTA come anti-coagulante.
• Grigio: contengono sodio floruro o potassio ossalato, vengono usate per quantificare glucosio, alcooli.