Bio-informatica molecolare

Bioinformatica introduttiva

Il biologo esegue degli esperimenti, interpreta dati e osservazioni ed elabora nuove teorie.

Il bioinformatico gestisce e valuta dati grezzi che sono stati prodotti dalle macchine di cui ci si avvale durante gli esperimenti, elabora anche programmi e software necessari per elaborare l'enorme mole di dati che derivano da questi esperimenti e infine genera e studia dati elaborati visualizzabili e interpretabili.

-> L'interazione tra le due figure avviene già all'inizio durante l'esperimento in corso.

Grafico e legge di Moore

Grafico: essendo una scala logaritmica la curva indica una crescita esponenziale.

Le linee tratteggiate indicano le 2 possibili previsioni messe a confronto con la legge di Moore (blu).

La legge di Moore è nata in ambiente elettronico come osservazione empirica, un ragionamento secondo cui il numero di transistor nel tempo sarebbe cresciuto raddoppiando ogni due anni. Indica l'andamento del numero dei chip nei processori.

È un fattore abilitante delle ultime due rivoluzioni industriali -> l'evoluzione dell'industria distinta in 4 step: quella legata all'energia del vapore, l'evoluzione di massa energia elettrica e catena di montaggio, avvento informatica e automazione ed infine "internet of things" cioè network e smartphone.

->> La capacità di sequenziare genomi o in generale produrre dati sta crescendo in modo esponenziale ancor più della legge di Moore. Questo è un fattore abilitante per una rivoluzione industriale come quelle viste in passato.

Tutti i dati pubblicati vengono raccolti in banche dati che sono open cioè chiunque può accedervi.

GeneBank e progetto genoma

GeneBank: ogni volta che un gene veniva individuato la sua sequenza veniva inviata a GeneBank e documentato attraverso vari articoli descrittivi la scoperta.

Nata inizialmente negli Stati Uniti e poi banche analoghe in Europa e Giappone e collaborazioni tra questi 3 istituti in cui avviene uno scambio giornalmente.

2.7 miliardi di dollari per il progetto durato decenni di sequenziamento dell'intero genoma.

Articoli scientifici

Articoli scientifici: ci sono 5 assi attraverso cui si può valutare un articolo.

• Novelty: ogni articolo scientifico deve dire qualcosa di nuovo. Altri articoli fanno una review in cui mettono insieme diverse scoperte già note, le riassumono, le integrano o le descrivono in un'ottica nuova. I manuali e libri nascono da un lavoro ulteriore di sintesi e integrazione di review e articoli.
• Relevance: impatta su quanto è importante l'osservazione di cui si parla.
• Accuracy: accuratezza e precisione che va di pari passo con la riproducibilità.
• Reproducibility: tutte le scoperte e invenzioni pubblicate devono essere riproducibili, quindi devono esserci tutte le informazioni necessarie.
• Impact: legato alla relevance che misura quanto è risultato importante questo lavoro nella comunità scientifica, se è utile e viene utilizzato.

L'impact factor viene misurato in base al numero di citazioni fatte da altri articoli: quelle con un basso impact factor raccolgono articoli importanti per nicchie specifiche e pochi esperti, un alto impact factor avrà importanza più ampia nel pubblico.

Un'ulteriore sintesi della scoperta va di pari passo a una diminuzione dettaglio delle informazioni che sono riportate, mentre l'accuratezza cresce cioè se c'era stato un dato sbagliato pubblicato questo con il progredire degli studi e analisi di quell'articolo può essere individuato e sostituito. La riproducibilità invece diminuisce perché ho bisogno di tutti i dettagli possibili con cui è stato fatto quell'esperimento quindi devo rifarmi agli articoli specifici.

-> La scienza parla solo di ciò che è riproducibile, l'osservazione deve permettere almeno ad un esperto del settore di riprodurla e verificarla.

La peer review "revisione tra pari" nell'ambito della ricerca scientifica è la procedura di valutazione e di selezione degli articoli o dei progetti di ricerca effettuata da specialisti del settore per verificarne l'idoneità alla pubblicazione o al finanziamento.

PubMed raccoglie tutti gli articoli scientifici, una sorta di banca dati per gli articoli.

Dati necessari ad identificare un articolo: autore, anno, titolo del lavoro, nome del giornale.

Struttura di un articolo

Struttura di un articolo: è caratterizzato dal nome della rivista in alto, titolo del lavoro con subito sotto riportati gli autori del lavoro e l'affiliazione degli autori. Infine prima della descrizione vera e propria c'è un abstract che sintetizza il contenuto.

L'articolo è poi diviso in sezioni:

• Introduzione che inquadra il contesto del lavoro, ricca di citazioni ai lavori precedenti, evidenzia domande aperte e problematiche che l'articolo affronta.
• Risultati contiene le affermazione (statement) che costituiscono il cuore dell'articolo, spesso accompagnate da illustrazioni.
• Materiali e metodi contiene le informazioni necessarie per riprodurre i risultati riportati nell'articolo.
• Discussione i risultati vengono ripresi e inquadrati nel contesto delle ricerche precedenti, se ne evidenzia la rilevanza e la novità, si discutono eventuali sviluppi futuri.
• Referenze con l'elenco degli autori citati.
• Materiali supplementari perché poche pagine spesso non sono sufficienti a descrivere come il lavoro è stato svolto nel dettaglio.
• Risultati supplementari tipicamente in forma di tabella o codice del software.

Banche dati

Banche dati: di tipo genomico, quelle che contengono i trascritti, quelle di proteine e poi volendo possiamo indagare sulle strutture delle proteine e quindi avremo delle banche dati di struttura, dei domini e salendo ancora possiamo interrogarci su interazioni tra le proteine, di pathway..ecc. Esistono anche data base legate alle modificazioni epigenomiche, delle malattie.

Un data-base è un elenco di dati strutturati nello stesso modo: la strutturazione è data da campi, ci sono record caratterizzati da campi diversi che ci servono per ricercare un dato (come una rubrica in cui cercando il nome di un collega possiamo trovare il suo numero di telefono o email).

Esempio di un dato in GeneBank: esempio di banca di articoli dove il PMID (PubMed id) ci permette di identificare l'articolo nella banca dati.

Esempio di banca nucleotidica.

L'identificativo univoco in GeneBank si può rappresentare come un link attraverso cui tramite un record cliccando su questo identificativo veniamo rimandati all'articolo in PubMed.

Ma oltre al PMID c'è anche l'identificativo DOI parecchio usato nelle biblioteche.

Banca dati secondaria: non ci sono ridondanze perché riorganizzano e rielaborano l'informazione contenuta nelle primarie secondo particolari criteri analitici. Tra queste, le banche dati specializzate raccolgono solo l'informazione relativa ad uno specifico settore, per esempio sequenze da lieviti, da anticorpi, proteasi, etc.

Nelle primarie come GeneBank tutti i ricercatori che lavorano su un gene o sequenza nucleotidica inviano i loro dati. Gene seq prende tutte queste sequenze e le elabora manualmente creando sequenze di riferimento in modo che non ci siano ridondanze.

RefSeq è una banca dati secondaria che lavora su sequenze nucleotidiche e proteiche.

UniProt contiene informazioni sulle proteine.

Entrez-gene (curato da NCBI) importante quando vogliamo sapere cosa fa un gene, raccoglie attorno all'identificativo di un gene tutti i trascritti che esso può generare, collega quindi i trascritti alle eventuali proteine che producono e si collega anche a UniProt - riferimenti incrociati che riconducono ogni informazione sui trascritti e proteine al gene in questione.

Genome-browser navigare il genoma, dove e come sono organizzati i geni, visualizziamo.

Valutazione degli articoli e studio sul Covid

Fenomeni che hanno un effetto piccolo, più l'effetto è piccolo più è facile che le affermazioni (claim) siano sbagliate. Più persone lavorano a un articolo più è probabile che qualcuno corregga eventuali errori.

Quante cose vengono dette in un articolo: se lo studio si focalizza su pochi argomenti è probabile che sia accurato, più lo studio è grande più aumenta la probabilità che ci sia qualcosa di sbagliato.

Esempio articolo sul Covid: in PubMed central si trova il testo completo, sull'altro tasto sulla destra si va all'articolo originale rimandandoci alla rivista.

Studio pilota condotto su 70 pazienti ma risultati ritenuti abbastanza validi da cercare di renderli più sicuri con ulteriori studi ed esperimenti su maggior numero di pazienti e centri diversi -> potrebbero esserci dei bias nello stesso centro.

Quando si legge un articolo è importante guardare se un lavoro ha un numero di citazioni molto alto, le affiliazioni.

Le ricerche che hanno un impatto medico immediato come gli studi su nuovi farmaci per combattere una malattia hanno percorso chemical trial molto rigoroso prima che i farmaci vengano usati, molto raro che ci siano errori, la comunità scientifica li valuta prima in modo accurato.

Record nucleotidici, CDS e browser genomico

CDS versione tradotta in termini di amminoacidi del record che stiamo guardando, in questo caso un record nucleotidico, un trascritto. Le sequenze UTR sono regioni non tradotte al 3' e 5' di un mRNA. Troviamo poi un identificativo univoco che ci rimanda alle proteine che produce.

Cliccando sulle diverse voci possiamo farci indicare i vari esoni, le sequenze in cui un enzima lega il substrato, le sequenze poliA, quelle regolatorie.

Tutti i riferimenti incrociati.

Visualizzazione a genom browser in cui si ha la sequenza nucleotidica di un cromosoma indicata su una retta x e poi delle tacchette che indicano la presenza degli esoni e una freccia per il verso in cui viene codificato il trascritto.

GeneBank contiene le sequenze nucleotidiche così come sono state inviate da un qualche autore, e contiene anche dei record, dei campi che contengono identificativi univoci per cui noi possiamo spostarci in altri data base che ci rimandano agli specifici articoli.

Banche dati secondarie come liveseq raccolgono tutte queste informazioni e le rendono più sintetiche e curate.

UniProt e TrEMBLE

Differenza tra UniProt e TrEMBLE: UniProt è composto da due sezioni: una generata automaticamente e una manualmente curata.

TrEMBLE è una grossa banca dati europea che contiene trascritti nucleotidici che vengono automaticamente convertiti in proteine ed inseriti in Swiss-Prot (sezione manualmente curata).

In silico translation si riferisce a un software che permette di tradurre il messaggio in proteina.

Codoni e open reading frame

Il genoma di un mammifero è composto per il 2% da sequenze codificanti proteine, 26% introni, grandissima porzione di sequenze ripetute n volte che hanno diverse funzioni nella regolazione genica.

In una open reading frame possiamo prendere ciascuna tripletta della sequenza e tradurla nel corrispondente amminoacido.

Ci sono 64 diversi codoni possibili: 4 tipi di basi per la prima posizione, altrettanti per la seconda e ancora per la terza posizione della tripletta o codone, quindi 4³ cioè 64. Ogni quante triplette in una sequenza casuale mi aspetto di avere un codone di stop? 3 ogni 64 codoni perché in tutto esistono 64 codoni ma esistono anche 3 tipi diversi di codoni di stop, quindi 1 ogni 21 triplette.

Inoltre si osserva che la lunghezza media di una proteina è di 300 residui cioè >> 21, questo vuol dire che le regioni che codificano per le proteine sono particolarmente povere di codoni di stop. Ma in una stessa ORF posso avere 3 frame di lettura diversi e posso capire qual è quella corretta individuando la ATG corrispondente alla metionina e TAG alla fine e soprattutto sarà quella più lunga!

Sul genoma devono esserci delle sequenze che contengono pochi codoni di stop cioè le regioni codificanti e 1 21 è solo un'ipotesi, una possibilità teorica.

Allineamenti di sequenza

Sappiamo dell'esistenza di strutture omologhe tra i vari vertebrati.

Il fenotipo è l'insieme di tutte le caratteristiche manifestate da un organismo vivente, morfologia, sviluppo, fisiologia, comportamento.

A definire il fenotipo contribuisce anche l'ambiente: durante l'evoluzione gli organismi cambiano in modo ereditabile, quindi cambia il genotipo, cambiano le informazioni genetiche che determinano le caratteristiche fondamentali del fenotipo.

Il genotipo è l'insieme delle informazioni ereditabili, ovvero che vengono trasmesse di generazione in generazione. Determina le caratteristiche fondamentali del fenotipo.

Funzione molecolare si sia adattata a una funzione diversa, a processo biologico diverso.

Omologia: due stringhe o strutture anatomiche hanno un antenato comune, strutture simili ma diverse funzioni.

Analogia: non comune antenato, strutture diverse ma stessa funzione.

Il DNA e le proteine sono dei polimeri costituiti da monomeri rispettivamente 4 nucleotidi e 20 aa -> possono essere considerate delle stringhe.

Se vogliamo confrontare ora diverse stringhe, cioè confrontare sequenze geniche di diverse specie, dobbiamo allinearle! Allineiamo le due stringhe attraverso 3 edit cioè 3 modifiche ma esistono diversi modi.

Sostituzione, rimozione e aggiunta di un nucleotide sono le 3 operazioni possibili per modificare le stringhe e renderle identiche a un'altra. Tra tutti i diversi tipi di allineamento quello più interessante sarà quello con il numero minore di operazioni.

-> Edit distance: quante operazioni elementari devo fare per passare dalla prima sequenza alla seconda, è la distanza tra le due stringhe.

Attraverso l'edit distance si può stimare la probabilità che due sequenze abbiano un antenato comune: tanto più lontano nel tempo tanto più distanti le sequenze.

• Se le sequenze sono troppo diverse non è probabile che ci sia un antenato comune.
• Posizioni caratterizzate da * sono posizioni di match, il . indica mismatch.

Ipotesi nulla e P-value

Ipotesi nulla: le sequenze sono casuali, i nucleotidi sono equiprobabili e sequenze sono entrambe lunghe L.

Se due sequenze sono completamente scorrelate, mi aspetto un match ogni 4 basi: assumendo che i 4 nucleotidi siano equiprobabili io in ogni posizione ho 1 4 di probabilità di ritrovare lo stesso nucleotide nell'altra sequenza -> La mia edit distance sarà di 3 L./4.

Se ho "tanti più" match di quelli che mi aspetto per caso (nell'ipotesi nulla) allora le sequenze hanno un antenato comune.

Possiamo calcolare il numero di questi match (sì sono 1 4 ma cioè quanti?) attraverso la statistica ottenendo un P-value.

Ma i nucleotidi non sono tutti equiprobabili ad es C e G sono meno frequenti.

Nel genoma si osserva che la frequenza con cui le G seguono C è molto meno di quello che ci aspetteremmo: in media sul genoma le G e C si presentano con una media del 20% l'una, quindi la frequenza di CpG (G che seguono C) atteso è 0.2x0.2 0.04=

Invece il risultato osservato è 21% dell'atteso, molto meno di ciò che ci aspettavamo.. questo potrebbe essere dovuto al fatto che la 5-metil-citosina tende a deaminare spontaneamente in timina.

-> Isole CpG sono regioni precise che tendono a non essere metilate e in queste regioni la frequenza di C e G è molto più alta di quella che ci si aspetta per caso.

Scoring system, gap e matrici

Scoring system: creo una matrice in cui assegno il valore di 1 per i match e di -2 per i mismatch quindi possiamo sommare tutti questi numeri in base ai match e mismatch e otteniamo uno score che misura la similarità tra le due sequenze.

Ad esempio possiamo utilizzare questo meccanismo per dare un peso diverso a mutazioni frequenti rispetto a quelle rare:

I gap negli allineamenti sono generati da eventi di inserzione o delezione nell'evoluzione. Questi eventi sono più rari dei cambi di nucleotide, sono più penalizzati e complicano notevolmente la statistica degli allineamenti. Generalmente si penalizza in modo diverso l'apertura e l'estensione del gap: si dà una penalità più grave all'apertura e meno all'estensione.

Sostituendo un aa acido di una proteina con un altro aa acido poco cambierà, invece sostituendo uno idrofilico con uno idrofobico la mutazione sarà più dannosa e spesso anche più rara perché non selezionata dall'evoluzione in quanto non favorevole.

Allineamento di proteine indica appaiamento, il . appaiamento simile ma diverso, : posizioni in cui non c'è | match ma due aa piuttosto simili quindi uno score abbastanza alto, vuoto aa molto diversi, - mismatch.

Matrici PAM si basano su un set piccolo di sequenze non molto sensibili allo scoring system e assumono che due sequenze siano vicine tra loro se contengono aa con caratteristiche biochimiche simili.

BLOSUM matrix invece di chiedere che la proteina sia simile in tante diverse specie, si utilizza in questo caso non l'intero allineamento ma ci si limita a dei blocchi ben conservati:

Se partiamo da blocchi simili otteniamo matrici indicate per ottenere un buon score e proteine vicine evolutivamente. Se i blocchi già in partenza hanno una percentuale di identità diversa otterremo proteine lontane.

PAM utilizza l'intera sequenza delle proteine.

Blosum solo porzioni di proteina ma che sono altamente simili ma solo in quel blocco.

Allineamento globale e algoritmi esatti

Allineamento globale: se ci sono due proteine scorrelate salvo per una porzione simile ad es un dominio transmembrana l'allineatore globale fallirà nel riconoscere queste sequenze, metterà un po' di gap qua e là raggiungendo il miglior allineamento possibile per le due sequenze ma non allineerà le due porzioni transmembrana. (Needleman-Wunsch)

Algoritmi esatti: data l'ipotesi nulla trovano esattamente il best score tra le due sequenze (globale) o tra parti delle due sequenze (locale) -> l'allineamento locale riconosce le due sottostringhe di A e B altamente simili e le ap