Appunti di Microbiologia generale

8 CF esercitazione 13 aprile

Prova scritta 11 domande aperte 60 minuti (punteggio max per domanda = 3), 10 riguardanti programma e 1 riguardo laboratorio orale facoltativo (+/- 2 pt).

1/03/202 virus come “oggetti”, non è vivo. Microbiologia studia i microrganismi (non visibili a occhio nudo) - esistono come cellule singole o come gruppi di cellule + studio dei virus.

I microrganismi si differenziano dai macrorganismi (es noi) perché possono svolgere un ciclo vitale indipendentemente da altre cellule.

E. coli: batterio gram-negativo simbionte, vive nel colon e ci fornisce vitamine e molecole con attività antibiotica.

Varianti di E.coli possono essere patogene per l’uomo.

Un’unica cell può dare discendenza infinita (riproduzione asessuata).

3 pilastri della microbiologia

• Fisiologia dei microrganismi (come sono fatti e come funzionano, metabolismo e nutrizione).
• Genetica (genomi, ereditarietà e come esprimono geni e come questi variano nel tempo).
• Ecologia (interazione che microrganismi stabiliscono con ambiente o altri organismi).

Ma anche biochimica microbica (enzimi e reazioni chimiche nelle cellule), sistematica microbica (classificare e dare un nome ai microrganismi), virologie applicazioni in campo medico (malattie infettive), agricoltura, industriale (antibiotici, bevande alcoliche…), acquatico, biotecnologico (produzione di proteine da organismi geneticamente modificati).

Microrganismi: dimensioni tra 10^-6 m (micron, batteri) e 10^-8 m (qualche decina di nanometri, virus).

Microscopio ottico (fino a 10^-7 circa) e elettronico.

Procarioti (batteri e archea).

Caratteristiche della cellula

Una cellula è tale in quanto è in grado di:

• Fare metabolismo: acquisire nutrienti e sostanze chimiche dall’ambiente e trasformarle grazie ad energia e liberando all’esterno degli scarti = per la produzione di nuove cellule.
• Si riproduce.
• Differenziare (per diversa espressione di set di geni in certe condizioni, per manifestazione di un fenotipo differente; con possibilità di ritornare in condizione vegetativa pre-differenziazione).
• Comunicare (scambio messaggi es chimici per variazione atteggiamenti individuali e sociali).
• Mobilità.
• Evoluzione nel tempo (cambiamenti fenotipici che sono risultato della selezione) - questo è in comune ai virus.

Espressione genica: batteri, funghi, protozoi hanno DNA a doppia elica che può replicare, trascrivere e tradurre.

Cenni storici

Cenni storici: Robert Hooke 1664 (ha visto e descritto organismi microscopici e ha scritto “micrografia”); van Leeuwenhoek (costruzione microscopio e osservazione dei corpuscoli “animalcula”); Pasteur (fermentazione lattica e alcolica, pastorizzazione latte, vino, sterilizzazione, vaccino contro antrace, vaccino colera polli e rabbia); Robert Koch (scoperta batterio responsabile della tubercolosi - “postulati del Koch”).

Postulati verificati qualora un microrganismo sia considerato responsabile di una malattia.

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Raggiungimenti della microbiologia negli ultimi 65 anni.

Primordi (van Leeuwenhoek, Pasteur, Koch).

Tra il 1941 e il 1986 periodo della microbiologia molecolare e generale (DNA come materiale genetico, struttura DNA, codice genetico, sequenziamento).

Dall’86 microbiologia molecolare, genomica e proteica (PCR).

Mondo microbico

Mondo microbico - due modelli:

• Modello procariota (delimitato da un involucro interno; “caos” interno) es. helicobacter modesticaldum.
• Modello eucariota (vedo involucri contenenti zone delimitate da membrane e grosso sacco centrale alcune delle quali definiscono spazi) es. Saccharomyces cerevisiae con d=8 micron.

Nota: pili (tubi di proteine) ≠ cilia.

Tassonomia se noi andiamo a considerare le parentele evolutive (filogenetiche) tra tutto ciò che vive in questo pianeta, questo può essere raggruppato in tre categorie.

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LUCA: last universal common ancestor (vissuto dai 3.5 ai 3.8 miliardi di anni fa - da LUCA si sono originati i 3 rami di batteri, archea, eucarioti).

Struttura e funzione della cellula procariotica

Organismi microscopici con dimensioni e forme varie.

La maggior parte hanno dimensioni nell’ordine di qualche micron (millesimo di mm).

Superbatteri (biovolumi di 200 milioni e 3 milioni di micrometri - quasi piccole cellule).

Forme: bacilli (eng: rod) e cocchi (sfere).

Cocchi: può diversi su un piano dando ordine a un diplococco; catenella di cocchi invece si chiamano streptococchi.

Su due piani danno origine a gruppi di 4 cellule/tetradi.

Bacilli: uno che si replica dando ordine a due che rimangono appicciati sono diplobacilli; poi streptobacilli.

Con forma più arrotondata sono coccobacilli. Incurvati sono vibrioni. Avvolto su se stesso sono spirilli o spirochete se gli avvolgimenti sono tanti.

Rapporto superficie-volume; più sono piccoli, meglio funzionano.

Nomi: nome del genere maiuscolo puntato, nome della specie esteso in corsivo (E.coli).

La forma di un procariota è determinata da due fattori: parete cellulare (se presente) e il citoscheletro.

Nello Staphylococcus aureus la forma è data sostanzialmente dalla parete cellulare; all’interno c’è un anello di una proteina (FtsZ).

Il citoscheletro ne determina l’allungamento (proteina MreB) —> bastoncelli.

Per i vibrioni: proteina crescentina che determina l’incurvazione.

Staphylococcus aureus: modello di batterio gram positivo.

Escherichia coli: modello di batterio gram negativo.

Al TEM vedo zona chiara centrale corrispondente al nucleoide/genoma. La zona intorno al nucleoide è più scura con puntini (ribosomi). Parete cellulare esterna alla membrana citoplasmatica/cellulare.

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La parete cellulare

La parete cellulare può essere Gram positiva o Gram negativa.

È una struttura rigida (non fluida come la membrana cellulare) che conferisce forma al procariota. Protegge da danni meccanici (es schiacciamento) e previene la lisi osmotica (maggior pare di procarioti vivono in ambienti ipotonici in cui l’acqua tenderebbe a entrare spontaneamente dentro, facendo aumentare il citoplasma fino a portare a lisi/scoppio della cellula).

Può anche avere funzione di barriera selettiva nei Gram-negativi.

Partecipa alla determinazione degli aspetti patogenetici delle infezioni sostenute dai batteri e può quindi essere bersaglio di molti antibiotici.

Sacculi: strutture residuali di parete cellulare dopo l’eliminazione della cellula contenuta all’interno (protoplasto).

Il lisozima presente nelle secrezioni mucose è importante nella immunità innata; è un enzima capace di degradare la parete cellulare di un batterio - zone di lesione nella parete in cui l’acqua che entra diluisce il citoplasma finché la membrana si lisa. Perché ciò che accada si deve essere in soluzione ipotonica (non isotonica, altrimenti il protoplasto fuoriesce senza spaccarsi/senza lisi della membrana).

Colorazione di Gram

Colorazione di Gram positivo o negativo in base alla reattività alla colorazione.

Come si fa: si prende un campione di microrganismi e lo si distribuisce sulla superficie di un vetrino con un’ansa da batteriologia. Uccisione di batteri con calore = fissazione al calore. Segue la colorazione e l’osservazione microscopica in immersione.

Nir—> primo colorante: cristal violetto - penetra nelle cellule e tutto si colora di viola.

Poi mordensatura: si aggiunge qualche goccia di iodio e ioduro di potassio; si complessa col cristal violetto dando origine a complessi insolubili.

Poi fase di decolorazione con soluzione di alcol e acetone che estraggono i complessi iodio-cristal violetto solo da alcune cellule. Le Gram+ rimangono viola, le Gram- sono colorless.

Poi colorazione di contrasto con safranina (rossa) che colora ciò che si era scolorato prima. Chi ha assunto safranina sarà Gram-, le cellule viole sono invece Gram+. Questo è a causa della differenza nelle pareti cellulari.

Nel G+ unico grosso strato principalmente di peptidoglicano, mentre nel G- due strati ed esternamente una membrana interna, molto simile a quella citoplasmatica.

Visti dall’esterno, il G+ ha una superficie liscia, mentre il G- appare rugoso a causa dalla presenza della membrana esterna.

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Ricorda che la membrana cellulare non fa parte della parete cellulare.

Peptidoglicano

Peptidoglicano forma una rete tridimensionale.

Parte glicanica: alternarsi di N-acetilglucosammina (NAG/G) (derivato del glucosio, acetilato) e di acido N-acetilmuramico (NAM/M). legami β,1-4; siti di taglio del lisozima - ruolo di protezione per noi dai batteri.

Questa struttura si ripete n volte. Il NAM è un derivato del NAG in cui in posizione 3 c’è una sostituzione con un gr di un acido lattico, con un gr -COOH libero che può essere legato da aa (parte peptidica) da legame peptidico. L-alanina alla quale è legato l’acido D-Glutammico (forma D, non L come ci si aspetta. Troviamo alternanza nella catena peptidica di L e D amminoacidi), poi in posizione 3 acido mesodiaminopimelico (forma L), poi in posizione 4 D-alanina. La differenza tra G+ e G- è l’aa in posizione 3. Nei Gram+ in posizione 3 abbiamo la L-lisina. Sovrabbondanza di gruppi reattivi. In entrambi i casi c’è una catena laterale che presenta un gruppo amminico che può fare legame peptidico col gruppo carbossilico di un aa carbossi-terminale (proprio nella D-alanina). Così il gr carbossilico possa formare un legame peptidico con gr amminico presente su un’altra catena di una fila parallela. Grazie alla presenza di questi due aa in posizione 3 che sporgono è possibile la formazione di legami interpeptidici (tra peptidi che appartengono a file parallele). Nei Gram- (es. E.coli) avrò legami interpeptidici 3-4 diretti; nei Gram+ legami interpeptidici tra posizione 3-4 con interposizione di 5 Gly, quindi legame interpeptidico indiretto. Grande rigidità.

Parete cellulare dei Gram positivi

Parete cellulare dei Gram positivi.

Nei Gram+ notiamo presenza di acidi teicoici; polimeri di glicerol-fosfato o di ribitol-fosfato (glicerol-teicoico (rossi) e ribitol-teicoico (verdi)); in nero legami peptidici.

Funzione: riserva di fosfato, attribuiscono carica negativa per attirare ad es. ioni metallici, positivi, fondamentali per il metabolismo delle cellule.

Li chiamiamo acidi lipoteicoici quando l’estremità verso la cell è legata covalentemente alle teste dei fosfolipidi del foglietto più esterno della membrana citoplasmatica.

Proteine associate alla parete cellulare (ma in quantità minore rispetto a quelle della parete dei G-).

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Parete cellulare dei Gram negativi

Parete cellulare dei Gram negativi.

Nei Gram- al microscopio elettronico si vede uno strato sottile più scuro, tra due strutture (membrana plasmatica e membrana esterna) con due strati più densi e uno in mezzo più chiaro.

Non ci sono acidi teicoici.

Struttura: membrana cell - rete di peptidoglicani, strato sottile - struttura a doppio strato lipidico in cui quello verso la cell è costituito da fosfolipidi, quello verso l’esterno è costituito da lipopolisaccaridi (è la membrana esterna, molto simile a quella citoplasmatica e fa parte della parete cellulare).

Spessore membrana esterna = circa 8 nm.

Quindi la parete cellulare di un G- sarà costituito dallo strato sottile di peptidoglicani e dalla membrana esterna.

Periplasma: spazio tra membrana cellulare e membrana esterna - ricco di proteine e ovviamente peptidoglicani (“annegano” nel periplasma).

Abbiamo pochi legami diretti 3-4 interpeptidici. Alcune di queste catene peptiche sono legate a livello della D-alanina a una lipoproteina che quindi collega covalentemente il peptidoglicano alla membrana esterna.

Lipopolisaccaride

Lipopolisaccaride (LPS - anche noto come endotossina); lipide di membrana, quindi antipatico. Rappresenta la firma (PAMP) specifica dei Gram-; lipide A (comune a tutti batteri G-; porzione idrofobica determinata dalla presenza delle code idrocarburiche degli acidi grassi che hanno esterificato dei residui/gruppi sulla molecola della NAG - consente inserimento nella membrana esterna), core polisaccaridico (comune a tutti i G- della stessa specie) e antigene O/polisaccaride O (più esterno - stimola produzione anticorpi - specifico per il ceppo isolato, può essere diverso all’interno della stessa specie per segmento interno che si ripete n volte, con n che può essere diverso).

Core: troviamo zucchero KDO (acido 2,3-ketodeossiottonico) lo troviamo solo nel LPS della parete dei G-; molecole a 7C Hep (eptosio, può essere fosforilato).

Forme del LPS: batteri con LPS completo danno origine a colonie lisce (S, smooth); altrimenti R, rough. La differenza risiede nello stato di completamento del LPS. Una via di mezzo è SR-LPS (semi-rough).

Proteine canale - porine (trimeriche, 6fi fi .. . . fi m . fi in rosa); filtrano molecole; alcune specifiche per le molecole da trasportare, importanti per il trasporto di nutrienti. Struttura tridimensionale a beta-barile; formate da foglietti Beta che vanno in senso antiparallelo tra loro formando dei cilindri.

Es: OmpA = outer membrane protein (funz strutturale), OmpC e OmpF (formano pori per passaggio di molecole idrofiliche piccole fino ai 750 Da), LamB (trimeriche, porine per il maltosio dall’ambiente esterno; passa nel periplasma grazie a un trasportatore e viene raccolto da proteine specifiche che lo trasportano dalla porina alla superficie della membrana plasmatica).

Lipoproteina in giallo; ancora il liquido fluido della membrana esterna al peptidoglicano.

Mureina o peptidoglicano = sinonimi; quindi lipoproteina morenica è quella che collega il peptidoglicano alla membrana esterna.

Quanto visto finora (per G+ e G-) è valido per batteri che hanno parete cellulare.

Batterio Mycobacterium tuberculosis

Batterio Mycobacterium tuberculosis.

Parete cellulare è una modificazione della parete cell di un G+; non si colora perché ha una parete estremamente idrofobica attraverso la quale non passano i coloranti.

Uso colorazione per acido e alcol resistenza - colorazione a caldo per facilitare ingresso del primo colorante e poi eseguire una decolorazione fatta con lavaggi di alcol etilico e HSO decolorando 4 tutto tranne il micobatterio che continua a trattenere il primo colorante (rosso).

Quello che si decolora verrà poi ricolorato con un colorante di contrasto (blu). Sarà così possibile mettere in evidenza cellule di M. tuberculosis.

Perché non si colorano col metodo di Gram? Perché la parete cellulare di un micobatterio è complessata da una serie di molecole idrofobiche che vanno a inserirsi sopra e dentro lo strato di peptidoglicano.

All’esterno dello strato di peptidoglicano troviamo molecole di arabinogalattano e acido micolico. Impermeabilità al passaggio di soluzioni acquose.

Sintesi della parete cellulare

Sintesi della parete cellulare in ambiente esterno.

Cocchi: si dividono e la parete cellulare sarà per metà vecchia e per metà di nuova sintesi aggiunta al peptidoglicano già preesistente di nuovi monomeri sintetizzati nel citoplasma della cellula.

Monomero base: disaccaride di M-G, con catena di 5 aa legata a M; gli ultimi due sono due molecole di D-alanina (ho un glicanpentapeptide); formatosi da UDP NAM e UDP NAG (uridindifosfato nam e uridindifosfato nag), si lega poi a un trasportatore di membrana, il bactoprenolo (molecola a 55C che presenta due gr P - idrofobico - consente al monomero il passaggio attraverso alla membrana citoplasmatica - si ribalta portando all’esterno il glicanpentapeptide). Le transglicosilasi catalizzano l’attacco di due monomeri; si libera il bactoprenolo che rientra e il ciclo può ripetersi.

Legami interpeptidici fatti dalle transpeptidasi/carbossipeptidasi presenti nel periplasma di G+ e G-.

L’idrolisi del legame peptidico del quinto aa (la seconda D-ala) fornisce l’energia necessaria 7fi fi fi fio fi fi e a s fl fi . ) . . affinché le transpeptidasi formino il legame 3-4 diretto/indiretto tra gr carbossilico della D-ala che rimane e il gr amminico del DAP di una fila glicanica parallela.

Le transpeptidasi sono il bersaglio molecolare delle penicilline, che impediscono proprio queste reazioni di transpeptidazione. Sono inibitori competitivi delle transpeptidasi. Se queste sono bloccate non si formano legami interpeptidici; le file glicaniche fluttuano e la parte cellulare perde rigidità, funzione di contenimento e protezione = lisi cellulare.

Non hanno attività tossiche su di noi in quanto noi non abbiamo parete cellulare di peptidoglicano/non abbiamo le transpeptidasi.

Un gruppo di Archea appartenenti ai metanogeni hanno una parete costituita da pseudo-peptiglicano (NAM e uno zucchero che non è acido N-acetilmuramico, ma NAT, acido N-acetiltalosaminouronico); i legami inoltre sono β 1-3, quindi resistono al lisozima. Inoltre troviamo solo aa in forma L che formano legami interpeptidici).

Se vogliamo distinguere batteri, archea, eucarioti dalla parete:

• Peptidoglicano (solo nei batteri) e quindi sensibilità ad antibiotici β-lattanici.

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Membrana citoplasmatica

Membrana citoplasmatica.

Qui troviamo concentrate funzioni essenziali per un procariota, mentre negli eucarioti queste sono distribuite nel sistema di membrane interne.

Simile a struttura di quella degli eucarioti.

Funzione primaria di contenere l’interno cellulare - controllo scambi con l’esterno - sede di importanti funzioni metaboliche (es metabolismo energetico).

Le proteine integrali hanno code che sporgono verso l’interno e verso l’esterno; LPP (lipoproteine) collega il doppio strato lipidico della membrana con il foglietto interno della membrana esterna.

Opanoidi: nei batteri sostituiscono gli steroli.

La maggior parte degli ac