Appunti di genetica

Appunti di genetica

Alessia C.

Università degli Studi di Torino

Biotecnologie

Primo anno, secondo periodo

2020/2021

Professoresse Altruda e Tolosano.

Libro di riferimento: “Biologia molecolare della cellula”, Alberts.

Alla fine del file troverete i riferimenti alle pagine del libro “Biologia molecolare della cellula” per ogni argomento trattato a lezione. Sono presenti degli approfondimenti.

Alessia C.

Introduzione: alcuni legami in genetica

! Forze di Van der Waals: legami non covalente.

! Emoglobina: struttura quaternaria con gruppo prostetico eme (contenente ferro).

! Legame tra ligando e proteina è non covalente.

DNA contiene le informazioni genetiche

! DNA (desossiribosio) e RNA (ribosio, uracile al posto di timina).

! Meischer: scopre DNA nel 1869, lo chiama nucleina, si pensava che avesse solo funzione strutturale. Non si sapeva se fossero le proteine o il DNA a portare l’informazione genetica.

! Garrod: propone teoria cromosomica di ereditarietà nel 1900.

! DNA procariotico: circolare, lo spazio tra i geni è solo 10%.

! Tipi di colonie: III S (liscia e tonda) e II R (rugose e frastagliate).

! Esperimento di Griffith (1928): ceppo S virulento uccide topo, ceppo R avirulento no. Se metto ceppo S ucciso dal calore, il topo vive, se metto ceppo S ucciso col calore insieme a ceppo R, il topo muore.

! Esperimento di Avery (1943/1944): metto ceppo R+ proteine e il topo vive, metto DNA + proteine e si crea ceppo S e il topo muore. Quindi è il DNA che porta le informazioni genetiche.

! Batteriofago T4: poche proteine eterogenee, stelo e capside con DNA.

! Esperimento di Herschey e Chase (1952): marcano selettivamente DNA (con 32-P) e proteine (con 35-S) e centrifugano. 35-S si trova nel surfactante e rompendo i fagi trovano proteine marcate perché rimangono fuori dal batterio. Quindi informazione genetica è nel DNA.

Alessia C.

! 1980: Dickerson conferma struttura a doppia elica B mediante cristallografia a raggi X.

Struttura del DNA

! Watson e Crick (1953): doppia elica con doppi legami tra A-T e tripli legami C-G. DNA ha carica negativa per i gruppi fosfato. Ciascuna delle eliche sa duplicarsi da sola. Filamenti antiparalleli.

! Basi puriniche: adenina e guanina, 2 anelli. Più ingombranti.

! Basi pirimidiniche: citosina, timina (o uracile in RNA). Un solo anello.

! Nucleotidi trifosfato: alfa, beta o gamma a seconda della posizione di C-5’. Adenina legata al C-1’ del desossiribosio, a sua volta legato dal C-5’ ai gruppi fosfato.

! Diffrattografia di un cristallo di DNA: Rosalind Franklin.

! Legami in DNA: a H tra basi complementari, covalenti (fosfodiesterici) tra acidi nucleici.

Duplicazione del DNA

! Fase S (“sintesi”): fase del ciclo cellulare in cui avviene la duplicazione del DNA, dopo questa fase il DNA si può trasmettere.

! Gruppo PO₄^-: si lega con C-3’ del nucleotide che si lega al filamento crescente.

! Nucleotide trifosfato aggiunto con rottura dei 2 legami più estremi di PO₄.

Alessia C.

! dNTP: monomeri di DNA, nucleotidi trifosfato.

! Enzima DNA polimerasi: duplica DNA da 5’ al 3’, non è in grado da sola di iniziare la duplicazione (ha bisogno di primer). Aggiunge deossiribonucleici all’estremità 3’-OH di una catena polinucleotidica accoppiata a un filamento stampo. Non può rompere legame a H da sola.

! Filamenti di DNA antiparalleli: 5’ di un filamento davanti a 3’ dell'altro.

! Forcella di replicazione: formata da DNA in cui i due filamenti sono separati per un tratto. I procarioti ne hanno due (e sintesi termina nella parte opposta).

! Filamento guida: sintesi procede in modo continuo.

! Filamento ritardato: duplicazione attraverso sintesi di brevi sequenze di DNA (Frammenti di Okazaki). Agisce allontanandosi da forcella di replicazione. Crea anse che si ingrandiscono e si riducono.

! DNA elicasi: usa energia di ATP per separare l’elica.

! Esperimento di Meselson e Stahl: la duplicazione è semiconservativa, il nuovo DNA ha un filamento nuovo e uno vecchio.

Alessia C.

! SSB: Single-strand binding proteins. Si associano a DNA e lo rendono stabilmente separato, impedendo le anse.

! DNA ligasi: usa ATP che si idrolizza a AMP per formare legami fosfodiesterici tra frammenti di Okazaki.

! DNA primasi: sintetizza i primer (inneschi) di RNA di 10 nucleotidi. Negli eucarioti i primer sono sintetizzati a intervalli di 200 nucleotidi sul filamento ritardato.

! Pinza regolabile: tiene legata la DNA polimerasi e la spinge, rendendola progressiva (costante nella sintesi).

! Nei batteri 3 DNA polimerasi, la I può correggere da 5’ a 3’ ma anche da 3’ a 5’. Nessuna parte da DNA intatto.

! Negli eucarioti 5 DNA polimerasi: alpha, beta, gamma, delta e epsilon. Solo la gamma si trova nei mitocondri.

! Attività esonucleasica: correzione bozze.

! Topoisomerasi: aiuta elicasi per il superavvolgimento, è punto di rotazione attorno ai legami covalenti del fosfato.

! Topoisomerasi II: reazione di attraversamento dell’elica, fa legame covalente con due filamenti e li taglia.

Telomerasi

• Telomeri: ripetizioni di nucleotidi nell’uomo, estremità del cromosoma.
• Cromosomi metafasici: si formano dopo replicazione del DNA.

! Il centromero contiene sequenze di DNA altamente ripetute (DNA satellite) e proteine.

! Ibridizzazione: per evidenziare telomeri. Si alza temperatura e si denaturano eliche, dopo si abbassa gradualmente temperatura e la doppia elica si riappaia. È una forma di riconoscimento molecolare.

! Se dopo ibridizzazione riporto subito a bassa temperatura, non ottengo ibridazione, ma stabilizzazione.

! Stringenza: forza ionica, in condizioni opportune (anche di temperatura) sono tollerati appaiamenti non perfetti. Si formano ibridi imperfetti.

! Informazione genetica al centro del cromosoma.

! Cellule somatiche di eucarioti perdono qualche centinaio di telomeri a ogni replicazione (perché primer si aggancia e deve essere eliminato). Cellule ossee e germinali non perdono telomeri.

! T-loop: anse, ripetizioni di sequenze che permettono l’ibridazione con una porzione interna alla sequenza telomerica.

! Telomerasi: ha almeno 3 basi complementari a DNA, si attacca al 3’. Fatta di proteine e RNA stampo.

! Topi knockout: geni inattivati, alla quarta generazione senza il gene che produce RNA per la telomerasi non possono più riprodursi, man mano i telomeri si sono erosi, fusi e persi. Quindi i telomeri servono per l’integrità dei cromosomi.

Alessia C.

Cromatina e nucleosomi

! Cromatina: DNA nel nucleo, fatta di istoni (proteine) e proteine non istoniche (per trascrizione). Si può colorare.

! Istoni: prima fase di compattamento del DNA. Da 102 a 135 amminoacidi, sintetizzati nella fase S, molto conservati. 50% di arginina e 50% di lisina (basiche).

! Nucleosoma: filo di perle in cui istoni vengono avvolti da DNA di 146 bp. Legame DNA-nucleosoma instabile. Ogni nucleosoma contiene 8 istoni (ottamero).

! Fibra a collana di perle di 11 nm => fibra da 30 nm) => Fibra ad ansa da 300 nm di diametro => 700 nm => 1400 nm (cromosomi metafasici tra mitosi e meiosi).

! Istone HI: della 5 classe, si attacca a nucleosoma dove DNA si stacca e attacca adesso.

! Istone H4: è l’istone più conservato, da mucca a pisello cambiano solo 2 amminoacidi.

! Modificazione su N-terminale: acetilazione (aggiunta di gruppi acetili), metilazione (aggiunta di gruppi metile), fosforilazione (aggiunta di gruppo fosfato).

! Modelli per fibra di cromatina di 30 nm: a solenoide e a nastro elicoidale.

Alessia C.

! Ciascuna molecola di DNA è stata compattata in nucleosomi, poi in fibra da 30 nm, poi in anse, infine in cromosoma che è 10 000 volte più corto della sua lunghezza estesa.

• Eucromatina: cromatina non densa, viene trascritta e non contiene sequenze ripetute.
• Eterocromatina: densa, non trascritta. Divisa in costitutiva (sequenze ripetute, senza geni) e facoltativa (decondensata per esprimere geni).

! Squilibrio nell’acetilazione altera la struttura della cromatina e regolazione aberrante di geni.

! Locus: posizione occupata da gene su un cromosoma.

Alessia C.

! Cromosomi presenti in duplice copia in animali.

! Alleli: varianti diverse dello stesso gene.

! Timidina viene impiegata per marcare la sintesi del DNA. È il nucleoside la cui base azotata è la timina.

Dimensioni del genoma

Alessia C.

• Operoni: insieme di geni adiacenti davanti a cui c’è promotore.

! Densità genetica: Bande G-scure A-T > 60%.

! Geni hanno A-T del 45-50%.

! Distribuzione sequenze EST (“sequenze espresse”).

! Umani hanno 27 mila nucleotidi; titina 281 mila e 300 geni; distrofina ha 2.5 milioni di nucleotidi e solo 78 esoni.

! 23% di geni umani per espressione, replicazione e mantenimento del genoma.

! Catene alpha e beta delle globine si sono formate contemporaneamente a mioglobina (lega reversibilmente ossigeno ed è più solubile in H₂O rispetto a emoglobina).

Genoma

! Geni che codificano proteine: aploidi o diploidi.

! UTR: sequenze non codificanti.

! DNA spacer non classificato: non ha funzione di gene, sequenze unica.

! Diploide: ha 2 cromosomi che portano in 2 alleli i geni duplicati.

! Sequenze ripetute:

• Ripetuto disperso:
  • DNA LINE (1000-7000 bp) o SINE (100-400 bp) che sono trasposoni non retrovirali.
• Ripetuto in tandem-DNA:
  • Satellite: unità da 5 a 100 bp, segmenti lunghi fino a milioni di basi. DNA satellite centromerico.
  • Minisatelliti: unità da 10 a 100 bp, lunghi fino a 25 kb. DNA teleferico.
  • Microsatelliti: unità maggiore di 4 bp, fino a 150 ripetizioni trinucleotidiche (sopra si ha distrofia miotonica).

Alessia C.

! Tecniche per ripetizioni in tandem: digestione e gradiente di densità.

! DNA fingerprinting: per differenziare individui.

! Trasposone: sposta informazioni a un bersaglio, si replica autonomamente se è retrotrasposone.

! LTR: ripetizioni terminali dirette.

RNA cellulari

! Struttura secondaria: piegata da legami a H, usata come segnale nella traduzione.

! Esistono 20 amminoacidi.

Alessia C.

! RNA distinti in base a S (Svegbergs), cioè la velocità di sedimentazione nella centrifuga proporzionalmente al peso. La S misura anche la conformazione della particella quando è analizzata da un gradiente di un sale pesante sottoposto all'azione di una centrifuga.

! mRNA: porta dal nucleo al ribosomi le informazioni che codificano per le proteine.

! tRNA: fa da adattore alle molecole nella sintesi delle proteine, traduce codoni di mRNA in proteine. 140 nucleotidi modificati, 50 tipi di modifiche chimiche. Almeno 20 tRNA.

! Sequenza iniziale ACC comune a tutti tRNA.

! La conformazione finale del tRNA è detta “L rovesciata” perché i bracci si vanno a sovrapporre, lasciando in evidenza le due estremità e l'anticodone.

! Caricamento di tRNA: enzima fa legare tRNA e amminoacido corrispondente, ci vuole energia fornita da ATP idrolizzato a AMP (si liberano 2 PO₄). Si attiva amminoacido che viene legato a AMP attraverso COOH.

! RNA in forma immatura si chiama hnRNA (“RNA nucleare eterogeneo”), ha fino a 50 mila nucleotidi.

Ribosomi

! Fatti di 4 RNA e proteine. Conservati, in grado di autoassemblarsi partendo da mRNA e proteine. Costituiti da due subunità, una maggiore e una minore, che possono trovarsi nel citoplasma (per la sintesi delle proteine citoplasmatiche) sia sul RER. Diversi nei procarioti e eucarioti.

! Ribosomi procariotici: se le subunità sono unite, il complesso è chiamato 70S. La subunità maggiore è detta 50S, quella minore è detta 30S. La subunità maggiore è fatta di due rRNA: 23S e 5S (i cui nucleotidi vengono complessati per formare 34 proteine ribosomiali). Quella minore ha solo 1 rRNA (16S da cui si formano 21 proteine ribosomiali).

! Ribosomi eucariotici: se le due subunità sono associate, il complesso si chiama 80S. La subunità maggiore è la 60S (3 molecole di rRNA, 5S, 28 S e 5.8S, complessati per formare 49 proteine ribosomiali) e la subunità minore è 40S (solo rRNA 18S, che forma 33 proteine ribosomiali).

! rRNA: ruolo catalitico e strutturale nei ribosomi. La regione non trascritta contiene la regione promotrice al 5’ del gene.

! Poliribosoma: più ribosomi da stesso mRNA, amplificazione di informazione genica di mRNA.

mRNA e codice genetico

! Batteri hanno codice genetico policistronico: più sequenze codificanti di DNA e più geni di operone.

! mRNA instabili, solo 2% di RNA. Vengono sintetizzati solo quando servono, poi distrutti.

! Trascritti primari maturano: incappucciamento sul 5’, poliadeninazione sul 3’ e splicing.

! Le modifiche su mRNA servono per: facilitare esportazione al citosol, proteggerlo da enzimi idrolitici e per aiutare i ribosomi a attaccarsi al 5’.

! Cappuccio al 5’: (subito dopo essere stato prodotto da polimerasi) nucleotide atipico, legame 5’-5’ tra il 7-metil G e l’estremità 5’ del trascritto. Ruolo nella sintesi proteica e nel proteggere da crescita e degradazione.

! Coda di poli-A al 3’: aggiunta da parte di poli-A-polimerasi. Taglio di 30 NT a valle di AAUAAA. Aiuta a esportare mRNA, stabilizza e ruolo in sintesi proteica.

Alessia C.

! Usando mRNA sintetici e analizzando la catena polipeptidi che si forma in vitro si può identificare l’aminoacido codificato da ogni tripletta.

! Codice genetico:

• A triplette non sovrapposte: parte di una tripletta non fa anche parte di altre triplette, si vede dalla finestra di lettura (vengono lette triplette consecutive e non sovrapposte).
• 4³ = 64 triplette di nucleotidi.
• Ridondante: gli aminoacidi sono 20, alcuni aminoacidi sono codificati da più triplette.
• Universale: uguale per tutti.
• Degenerato: più codoni possono codificare per lo stesso aminoacido (le triplette conservano le prime due posizioni e cambia la terza). Serve per proteggersi da mutazioni.
• AUG ha codone di inizio: codifica per amminoacido metionina.
• UAA, UAG e UGA hanno codoni di stop: ad essi non corrisponde un amminoacido.

! Mutazioni puntiformi: riguardano 1 o poche basi. Portano a mutazioni missenso (codificano ancora per aminoacido, ma non per forza per quello giusto) o non senso (basi codificanti per una proteina cambiate in cotone di stop, proteina risultante non è funzionale).

! Con 3 basi UCG si possono formare 6 combinazioni (n! = n x (n-1) x (n-2) x (n(n-1) x 1 = 3 x 2 x 1 = 6).

! tRNA può attaccarsi a più codoni, 3° posizione di mRNA-1° su tRNA hanno legame meno stretto.

! Codone si trova su mRNA, l’anticodone sul tRNA.

Alessia C.

• L’immagine sopra riportata mostra come leggere le triplette.
• In una catena polipeptidica, il legame tra codone e anticodone (3 nucleotidi del tRNA) garantisce il giusto allineamento degli amminoacidi.

! Mutazioni puntiformi: riguardano 1 o poche basi. Portano a mutazioni missenso (codificano ancora per aminoacido, ma non per forza per quello giusto) o non senso (basi codificanti per una proteina cambiate in cotone di stop, proteina risultante non è funzionale).

! tRNA può attaccarsi a più codoni, 3° posizione di mRNA-1° su tRNA hanno legame meno stretto.

Vacillamento (wobble): Alcuni amminoacidi hanno più di un tRNA e alcuni richiedono un appaiamento accurato delle basi soltanto nelle prime due posizioni del codone, si possono quindi tollerare un appaiamento sbagliato (tentennamento) nella terza posizione. Questo spiega perché tanti codoni alternativi per un amminoacido differiscano soltanto nel terzo nucleotide.

Alessia C.

Trascrizione: da DNA a RNA (nel nucleo)

! Trascrizione produce RNA a singolo filamento complementare a DNA.

! Legame fosfodiestere: covalente, tra ribosio di catena fosforibonucleica e PO₄ di C-5’.

! Modello a Albero di Natale: 2 geni trascrivono nella stessa direzione.

! RNA polimerasi: ha sito catalitico in cui lega ribosio-3fosfato, svolge attività di elicasi, bolla di trascrizione è di 10-12 NT, è capace di iniziare il trascritto da solo da 5’ a 3’ (ma copia DNA da 3’ a 5’). È composta da più subunità.

! Trascrizione: iniziazione (capire da dove iniziare), allungamento e terminazione.

! Sequenza CTD: nella fase di allungamento. Aggiunta di gruppi fosfato alla coda della RNA polimerasi (dominio C-terminale). Negli umani il CTD è fatta di 52 ripetizioni in tandem di una sequenza di 7 amminoacidi.

! Fase Sigma: i procarioti la usano per capire da dove iniziare la trascrizione e hanno una sola RNA polimerasi.

! -35, -10 e +1 (inizio) permettono di capire le sequenze riconosciute da sigma che permettono legame all’inizio dei geni.

! Sequenze consenso: motivi monotoni e conservati. In posizione -10 nei procarioti c’è il TATA BOX, che negli eucarioti è in posizione -25 a partire da +1

Alessia C.

! RNA polimerasi: I (rRNA 28 S, 5.8 S e 18 S), II (geni codificanti proteine, SNRNA) e III (tRNA, 5S rRNA, u6-SNRNA, piccoli rRNA nucleari e citoplasmatici).

! Sequenze CpG: metilazione su citosina legata a G. P sta per “fosfato”. Propria dei geni “house-keeping” (cioè che codificano proteine per il normale funzionamento di cellula), la trascrizione inizia a siti multipli a distanza di 20-200 bp.

! Fattori generali di trascrizione: proteine che assemblano RNA al promoter prima della trascrizione e staccano RNA polimerasi nella fase di elongazione. Attività combinatoria per poter rispondere a diversi stimoli.

! TATA BOX: promoter per formare il complesso di iniziazione.

! Terminazione diversa in procarioti (trascrizione si ferma alla fine del terminatore) e eucarioti.