pexolo di pexolo
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Questa metodologia, sviluppata negli anni ‘70 dai premi Nobel Neher e Sakmann , permette lo studio dei flussi ionici che attraversano uno o più canali ionici, e viene quindi utilizzata per capire i meccanismi alla base del funzionamento di queste proteine.
Al fine di registrare le correnti che attraversano la membrana plasmatica, si utilizza un amplificatore collegato a due elettrodi, i quali vengono messi a contatto con le soluzioni elettrolitiche che bagnano i lati opposti della membrana. Dei due elettrodi, uno viene posto nella soluzione extracellulare in cui risiede la cellula, e quindi in contatto elettrico con la parte extracellulare della membrana plasmatica. Il secondo elettrodo viene invece posizionato all’interno di una pipetta di vetro contenente una soluzione elettrolitica. Con l’aiuto di micromanipolatori si porta la punta della pipetta a contatto con la cellula, e si applica una suzione che crea una forte adesione della membrana plasmatica alla pipetta di vetro. La configurazione così ottenuta viene chiamata “cell-attached”, e può essere utilizzata per registrare l’attività dei canali ionici. Infatti se nel lembo di membrana che aderisce alla pipetta di vetro si trovano dei canali ionici, i flussi ionici che li attraversano potranno essere amplificati e registrati. Esistono poi altre configurazioni possibili, le quali si ottengono a partire dalla configurazione di cell-attached con ulteriori manovre. Ad esempio è possibile allontanare bruscamente la pipetta di vetro dalla cellula. Nella maggior parte dei casi il lembo di membrana a contatto con la pipetta verrà staccato dalla restante membrana plasmatica. In questo modo si ottiene la cosiddetta configurazione “inside-out”, chiamata cosìpoiché la parte intracellulare del lembo di membrana (inside) viene a trovarsi in contatto con la soluzione che bagna la cellula (out). Anche in questa configurazione è possibile registrare le correnti ioniche che attraversano i canali che sono presenti nel lembo di membrana isolato. Rispetto alla configurazione “cell-attached”, la configurazione “inside-out” ha il vantaggio di poter controllare la soluzione che bagna il lato intracellulare del canale, potendo ad esempio saggiare gli effetti di modulatori che si legano al lato intracellulare del canale. Una configurazione alternativa la si ottiene, sempre a partire dalla configurazione “cell-attached”, applicando una forte suzione tale da rompere il lembo di membrana a contatto con la pipetta di vetro. In questa configurazione, chiamata “whole-cell” l’elettrodo all’interno della pipetta viene ad essere in contatto con l’ambiente intracellulare, e potrà quindi registrare i flussi ionici che attraversano i canali presenti in tutta (whole) la membrana plasmatica della cellula. Infine, a partire dalla configurazione “whole-cell” è possibile allontanare la pipetta dalla cellula. Nella maggior parte dei casi questa manovra porta al distacco di un lembo di membrana, dal quale sarà possibile registrare i flussi ionici dei canali presenti. Contrariamente alla configurazione “inside-out”, in questa nuova configurazione, chiamata “outside-out”, il lembo di membrana isolato espone la sua parte extracellulare alla soluzione che bagna la cellula. Per questo motivo questa configurazione è utile per lo studio di modulatori che agiscono dal lato extracellulare del canale.

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