pexolo di pexolo
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La determinazione della sequenza aminoacidica di ciascuna della quattro diverse subunità fu fatta utilizzando la seguente procedura. Si creò innanzitutto una libreria di cDNA dall’organo elettrico della Torpedine. Parallelamente si purificarono dallo stesso tessuto le varie subunità del recettore dell’Ach, e se ne determinò, con metodi biochimici classici, la sequenza aminoacidica di brevi segmenti. La conoscenza di tali sequenze aminoacidiche parziali consentiva di sintetizzare una molecola di DNA complementare a una porzione del cDNA e, quindi, utilizzabile come sonda per identificare il cDNA stesso. Si determinò infine la sequenza nucleotidica dei cDNA isolati, dalla quale si dedussero le sequenze aminoacidiche complete. Questi risultati mostrarono che le quattro diverse subunità del recettore dell’Ach presentavano un elevato grado di omologia nella loro struttura primaria.
La sequenza primaria di una proteina può dire molto sulla sua struttura e disposizione nello spazio. Utili indicazioni derivano dallo studio di proteine di cui si è potuto determinare sia la sequenza aminoacidica che la struttura, così da stabilire correlazioni tra specifiche sequenze e ipotizzare strutture secondarie della proteina. Per esempio, residui di cisteina possono formare ponti disolfuro, cioè forti legami tra porzioni linearmente anche distanti della proteina. La prolina, per la sua peculiare struttura, consente ripiegamenti bruschi della proteina. Le ormai ben note sequenze aminoacidiche dei siti di glicosilazione localizzano i rispettivi segmenti nella porzione extracellulare, mentre le sequenze di forforilazione indicano una localizzazione citoplasmatica. Infine se una parte della proteina è formata da aminoacidi altamente idrofobici, allora essa sarà disposta in maniera da non essere in diretto contatto con l’acqua (all’interno della proteina oppure all’interno della membrana plasmatica).

Essendo i canali ionici inseriti nello spessore lipidico della membrana, con porzioni esposte nell’ambiente intra- e extracellulare, il grado di idrofobicità dei vari segmenti della proteina-canale rappresenta un parametro di particolare rilievo per diagnosticare la topologia transmembrana. I venti aminoacidi che formano le proteine hanno a questo riguardo proprietà molto differenti, potendo essere polari o non polari. Probabili segmenti transmembrana saranno quindi segmenti altamente idrofobici costituiti da sequenze di circa 20 aminoacidi, quanti ne sono necessari nella struttura a α-elica per attraversare lo spessore di circa 30 A della membrana. Il grafico di idropaticità della subunitàdel recettore per l’Ach viene costruito assegnando un indice di idropaticità a ciascun aminoacido della catena peptidica, e calcolando tale indice per gruppi di 20 aminoacidi adiacenti. Sono presenti quattro picchi positivi, idrofobici, interpretati come corrispondenti a segmenti -elica transmembrana denominati M1, M2, M3 e M4.Sulla base di questo dato, unito al fatto che la porzione N-terminale della subunità contiene siti di glicosilazione (che si localizzano solitamente a livello extracellulare) si è ipotizzata la topologia transmembrana. Esperimenti di mutagenesi uniti all’elettrofisiologia suggeriscono che dei quattro segmenti M1-M4, il segmento M2 formerebbe la parete del poro centrale, mentre i restanti segmenti, posizionati più esternamente, sono in diretto contatto con la fase lipidica. Infine, la massiccia porzione extracellulare del canale, che si evidenzia dalle immagini di microscopia elettronica, è costituita dalle porzioni N-terminali delle varie subunità’. Come vedremo successivamente, questa zona forma il sito di legame per l’Ach.

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