Concetti Chiave
- La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi alla catena in crescita nella direzione 5' → 3', rispettando la complementarietà con il filamento stampo.
- Esistono diverse DNA polimerasi nei procarioti ed eucarioti, ognuna con ruoli specifici nella replicazione e riparazione del DNA.
- La polimerasi III è l'enzima principale per la replicazione nei batteri, mentre la polimerasi I è necessaria per rimuovere gli inneschi di RNA.
- Mutazioni nelle polimerasi possono causare effetti letali, ma alcuni mutanti termosensibili aiutano a chiarire le funzioni delle varie polimerasi.
- La replicazione del DNA inizia in specifiche origini, caratterizzate da sequenze ricche in adenina e timina per facilitare l'apertura della doppia elica.
Indice
Funzione della DNA polimerasi
• La DNA polimerasi aggiunge un nucleotide alla estremità 3’OH della catena in crescita: La direzione di crescita è sempre e solo 5’ → 3’.
• L’aggiunta dei nucleotidi non avviene a caso ma rispettando la complementarietà con il filamento opposto che fa da stampo.
• Gli errori per inserzione di nucleotidi sbagliati sono rari e sono corretti dalla DNA polimerasi (esonucleasi) grazie alla rimozione del nucleotide errato in direzione 3’ --> 5’ (proof-reading o”correzione delle bozze”).
Varietà di DNA polimerasi
• Esistono varie DNA polimerasi sia nei procarioti che negli eucarioti e molte altre proteine la cui attività serve alla replicazione del DNA. In effetti la replicazione del DNA è un processo molto complesso a livello molecolare.
I batteri hanno polimerasi I,II,III.
Attività esonucleasiche= una nucleasi un enzima che degrada il DNA, dall’esterno, parte dal nucleotide all’estremità.
L’esonucleasi I 5’3’ cioè stessa direzione della polimerasi. Serve per rimozione degli inneschi, che in natura sono a RNA. La polimerasi III (I e II ciascuna sono codificate da un gene) la III codificata da più geni che codifica per una delle subunità l’oloenzima.
Esistono tante altre polimerasi IV e V, hanno un ruolo nella riparazione del DNA.
La polimerasi I è l’unico ad avere attività esonucleasica 5’ 3’.
Non è l’enzima principale per la replicazione dei batteri ma enzima necessario per rimuovere gli inneschi.
Mutazioni e loro effetti
• Difetti dovuti a mutazioni nei geni per le polimerasi e le proteine che partecipano al processo della replicazione sono generalmente letali perché la replicazione è una funzione essenziale della cellula.
• Esistono però mutanti particolari, detti termosensibili, nei quali le polimerasi interessate dalle mutazioni funzionano alla temperatura fisiologica, ma oltre (42°C) presentano anomalie. Questi mutanti sono serviti a definire esattamente il ruolo delle varie polimerasi e anche di altre proteine che partecipano alla replicazione.
• Ad esempio il mutante polAex1 della DNA Polimerasi I di E.coli è w.t. a 37°C. A 42°C presenta attività di sintesi di DNA quasi normale ma perde l’attività esonucleasica 5’-->3’. A 42°C i mutanti polAex1 muoiono, quindi questa attività esonucleasica 5’-->3’ della Pol I è essenziale.
Scoperta di nuove polimerasi
• Lo studio di molti mutanti della replicazione dimostrò che dovevano esistere altre polimerasi in aggiunta alla Pol I: furono così scoperte la Pol III e la Pol II. – Ad es. un mutante (polC) replica normalmente il DNA 25°C ma non a 42°C: le cellule a 42°C interrompono la replicazione del DNA e poco dopo muoiono. Si scoprì che PolC è un mutante della Pol III (locus dnaE), che inattiva la sintesi di DNA 5’ → 3’.
• L’enzima “principale” della replicazione del DNA è proprio la Pol III, non la Pol I.
Origini della replicazione
• La replicazione non inizia ovunque, ma in appositi siti, le origini.
• Il DNA che costituisce le origini ha una sequenza particolare, spesso ricca in A e T per facilitare l’apertura localizzata della doppia elica, dovuta al legame di specifiche proteine.
Domande da interrogazione
- Qual è la direzione di crescita della DNA polimerasi durante la replicazione?
- Come vengono corretti gli errori durante l'inserimento dei nucleotidi?
- Qual è il ruolo della DNA polimerasi I nei batteri?
- Cosa sono i mutanti termosensibili e quale importanza hanno nello studio delle polimerasi?
La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi alla catena in crescita esclusivamente nella direzione 5’ → 3’, partendo dall'estremità 3’OH (come indicato nel testo).
Gli errori di inserimento di nucleotidi sbagliati sono rari e vengono corretti dalla DNA polimerasi attraverso un'attività di esonucleasi, rimuovendo il nucleotide errato in direzione 3’ → 5’ (proof-reading).
La polimerasi I non è l'enzima principale per la replicazione nei batteri, ma è necessaria per rimuovere gli inneschi a RNA, avendo un'attività esonucleasica 5’ → 3’ (come descritto nel testo).
I mutanti termosensibili funzionano a temperatura fisiologica ma presentano anomalie oltre i 42°C. Questi mutanti hanno aiutato a definire il ruolo delle varie polimerasi e delle proteine nella replicazione, evidenziando l'importanza dell'attività esonucleasica della Pol I (come spiegato nel testo).
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